Page 75 - 2019年11月第30卷第21期

表1 线性关系与定量下限考察结果 方法处理后，进行 LC-MS/MS 分析。受试者血浆中 4 种
Tab 1 Results of linear relations and quantitative low- 待测物的测定结果见表5。
er limits 表5 受试者血浆中4种待测物的测定结果（n＝90）
待测物 线性范围 ，ng/mL 回归方程 r 定量下限，ng/mL Tab 5 Results of four analytes in subjects’plasma
CLPCA 100～10 000 y=0.000 326x-0.001 33 0.999 6 100 （n＝90）
CLP 0.2～20 y=0.229x+0.011 2 0.999 9 0.2
2-O-CLP 0.3～30 y=0.085 7x+0.006 21 0.999 7 0.3 待测物 浓度，ng/mL
CLPTM-D 0.5～50 y=0.009 35x+0.000 08 0.999 5 0.5 CLPCA 2 752.09±427.5
CLP 4.48±1.1
表2 精密度和准确度结果（n＝5）
2-O-CLP 1.11±0.3
Tab 2 Results of precision and accuracy tests（n=5） CLPTM-D 17.30±5.5
（n＝5） 3 讨论
待测物 理论浓度，ng/mL 实测浓度，ng/mL 批内RSD，％ 批间RSD，％ 准确度，％ 3.1 本研究的意义
CLPCA 100 98.74 3.5 8.4 97.7
300 294.17 8.2 5.9 98.1 CLP为前药，其体内代谢过程会直接影响药物疗效
5 000 4 732.21 5.2 4.3 94.6 的发挥 。有文献报道介导 CLP 非活性代谢产物生成
[12]
8 000 7 766.22 7.5 6.2 97.1 [14]
CLP 0.2 0.19 7.0 8.1 95.3 的羧酸酯酶活性改变会显著影响CLP疗效 ，即除了活
0.6 0.58 2.9 4.2 96.5 性代谢产物CLPTM，非活性代谢产物CLPCA的浓度也
10 9.54 4.7 3.7 95.4 与药物疗效密切相关。因此，为了全面、系统地考察
16 14.96 4.9 5.5 93.5
2-O-CLP 0.3 0.30 5.5 6.1 98.9 CLP的体内代谢过程，本研究建立了测定人血浆中CLP
0.9 0.86 3.1 4.6 95.9 及其3种代谢产物（包括活性代谢产物和非活性代谢产
15 14.30 4.9 6.0 95.3 物）的 LC-MS/MS 方法。考虑到血浆中 CLPCA 的浓度
24 22.96 6.1 5.9 95.7
CLPTM-D 0.5 0.48 4.7 8.9 96.8 远远高于另外 3 种待测物（浓度差异达到 2～3 个数量
1.5 1.47 3.4 6.7 97.8 级），同时测定存在较大困难，本研究分别建立了 CLP-
25 23.68 4.4 7.8 94.7
40 37.53 9.5 7.6 93.8 CA 和 CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 的检测方法。此外，为
表3 提取回收率和基质效应结果（n＝5） 了测定4种待测物的含量，本研究选择患者服药后2 h作
Tab 3 Results of extraction recovery and matrix ef- 为采血时间点，此时CLP尚未完全代谢。
fect tests（n＝5） 3.2 前处理方法和色谱条件的优化
提取回收率，％ 基质效应，％ 在建立LC-MS/MS定量分析方法时，本研究对样品
待测物 理论浓度，ng/mL
x±s CV x±s CV 处理方法、色谱柱、流动相、柱温等条件进行了系统优
CLPCA 300 87.9±4.5 5.1 98.4±5.6 5.8
5 000 85.4±2.5 2.9 化。虽然液液萃取可有效去除磷脂等干扰组分，但该方
8 000 95.0±3.6 3.8 93.5±2.6 2.7 法操作烦琐、费时，同时会消耗大量的有机试剂，故选择
CLP 0.6 90.5±3.5 3.9 98.7±4.1 4.3 了操作简便、提取效率较为稳定的蛋白沉淀法进行样品
10 91.4±2.5 2.7
16 95.9±1.5 1.6 94.4±2.9 3.0 前处理。本研究前期考察了Inertsil ODS-3（100 mm×2.1
2-O-CLP 0.9 92.4±7.1 7.7 96.8±5.3 5.3 mm，5 μm）、Agilent SB-C18 （50 mm×4.6 mm，1.8 μm）、
15 86.7±1.4 1.6
24 91.1±2.1 2.3 98.1±5.1 5.2 Agilent poroshell 120 EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）
CLPTM-D 1.5 84.9±3.1 3.7 91.6±6.2 6.2 等色谱柱，结果显示 Agilent poroshell 120 EC-C18 （150
25 85.7±3.1 3.7 mm×3.0 mm，2.7 μm）色谱柱可提供更好的分离效率和
40 91.3±3.3 3.6 90.3±5.4 5.5
更对称的色谱峰形。选择流动相中有机相时，与甲醇相
表4 稳定性结果（n＝5）
比，乙腈可显著提高待测物的响应并降低噪音，因此选
Tab 4 Results of stability tests（n＝5）
用乙腈作为有机相。考察发现流动相的酸度对待测物
理论浓度， 25 ℃放置4 h -80 ℃放置3个月 3次冷冻-解冻 自动进样器4℃放
待测物
ng/mL 的RE，％ 的RE，％ 循环的RE，％ 置8 h的RE，％ 的分离和保留有显著影响，本研究通过试验发现流动相
CLPCA 300 -0.1 3.8 -4.7 -2.9 中加入 0.1％甲酸可获得对称尖锐的峰形，故在有机相
8 000 -3.8 6.6 3.1 -4.0 和水相中均添加0.1％甲酸。本研究还考察了不同柱温
CLP 0.6 -1.6 -3.3 2.5 -3.7
16 -2.1 1.5 1.3 -3.6 （20、25、30、35 ℃）对色谱峰展宽和保留时间的影响，结
2-O-CLP 0.9 -59.4 -4.4 5.6 -10.0 果显示筛选的柱温对待测物的定量检测影响较小，最终
24 -61.0 -2.2 2.1 -6.7
CLPTM-D 1.5 -0.9 2 1.4 -3.6 选用与实验室环境温度一致的25 ℃。
40 1.6 4 -2.2 -1.4 3.3 CLPTM-D稳定性考察

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