Page 73 - 2019年11月第30卷第21期
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量浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10、20 ng/mL，2-O-CLP 坐标（y），用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方
的质量浓度分别为 0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15、30 ng/mL， 程。线性关系与定量下限结果见表1。
CLPTM-D 的质量浓度分别为 0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、 2.6 精密度与准确度考察
50 ng/mL。 按“2.2.1”项下方法制备定量下限和低、中、高质量
2.2.2 内标溶液的制备 取噻氯吡啶对照品适量，用乙 浓度 4 个水平的标准血浆样品，作为质控样品，其中
腈配制得到质量浓度为2 mg/mL的噻氯吡啶贮备液，并 CLPCA的质量浓度分别为100、300、5 000、8 000 ng/mL，
将其稀释至200 ng/mL作为内标溶液。 CLP 的质量浓度分别为 0.2、0.6、10、12 ng/mL，2-O-CLP
2.2.3 血浆样品溶液的制备 ①衍生化反应：取人全血 的质量浓度分别为 0.3、0.9、15、24 ng/mL，CLPTM-D 的
4 mL 至 EDTA 抗凝管中，迅速加入 125 μL BMP 乙腈溶 质量浓度分别为 0.5、1.5、25、40 ng/mL。再按“2.2.3”项
液（100 mmol/L），4 ℃下3 000 r/min离心5 min后分离血 下方法处理后，进行 LC-MS/MS 分析。分别考察 3 个分
浆。②血浆样品处理：取血浆样品 100 μL 至 1.5 mL EP 析批，每批、每个浓度5个样品。应用当日校正曲线计算
管内，加入内标溶液20 μL和乙腈1 000 μL，涡旋30 s混 各质控样品中 CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 的浓
匀，4 ℃下 13 000 r/min 离心 5 min，取上清液用 0.22 μm 度，考察批内、批间精密度和准确度。结果显示，CLP-
滤膜过滤后进行LC-MS/MS分析。 CA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 在各质量浓度水平的批
2.3 色谱条件与质谱条件 内RSD在2.9％～9.5％之间（n＝5）、批间RSD在3.7％～
2.3.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Agilent poroshell 120 8.9％之间（n＝5）、准确度在 93.5％～98.9％之间（n＝
EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流动相：含0.1％甲酸 5），均符合有关生物样品分析方法验证的要求。精密度
的乙腈溶液-含 0.1％甲酸水溶液（90 ∶ 10，V/V）；柱温： 和准确度结果见表2。
25 ℃；进样器温度：4 ℃；流速：0.35 mL/min；进样量： 2.7 提取回收率和基质效应考察
2 μL。 2.7.1 提取回收率 按“2.6”项下方法制备低、中、高质
2.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子化源（ESI），多反应 量浓度的 CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 质控样品，
正离子检测模式进行定量检测；定量分析的检测离子对 每个浓度平行制备5份，按“2.2.3”项下方法处理后，进行
CLPCA 质 荷 比（m/z）为 308.1→ 198.1，CLP m/z 为 LC-MS/MS分析，测得待测物峰面积A1；另取空白血浆，
322.3→212.0，2-O-CLP m/z 为 338.3→155.0，CLPTM-D 按“2.2.3”项下方法处理后再加入相应质量浓度的对照
m/z 为 504.4→354.1，噻 氯 吡 啶（内 标）m/z 为 264.0→ 品溶液，进行LC-MS/MS分析，测得待测物的峰面积A2，
154.1；CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 和内标的去簇 以 A1/A2×100％计算提取回收率。结果显示，CLPCA、
电压（DP）分别为44.5、116.6、116.7、32.1、58.0 V；碰撞能 CLP、2-O-CLP 和 CLPTM-D 的提取回收率在 85.4％～
量（CE）分别为23.9、22.0、34.2、24.1、25.1 eV。离子源参 95.9％之间，CV均＜8％（n＝5），表明提取方法对结果的
数设定如下，气帘气：25 psi；雾化气：40 psi；辅助加热 影响小。提取回收率结果见表3。
气：60 psi；离子源温度：550 ℃；离子源电压：4 000 V；碰 2.7.2 基质效应 分别取 6 名受试者的空白血浆 100
撞活化解离设置为“Medium”。 μL，按“2.2.3”项下方法处理，取上清液，即得空白基质。
2.4 专属性考察 向空白基质中分别加入低、高质量浓度的CLPCA、CLP、
取6名受试者的空白血浆，以及空白血浆加入CLP- 2-O-CLP、CLPTM-D的对照品溶液，使最终浓度与“2.6”
CA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 和受试者服药 2 h 后的血 项下低、高质量浓度的质控样品对应，每个浓度平行制
浆样品，除空白血浆不加内标外其余均按“2.2.3”项下方 备 5 份，进行 LC-MS/MS 分析，测定待测物的峰面积 A。
法处理后，进行 LC-MS/MS 分析。结果显示，CLPCA、 另制备与上述对应质量浓度的 CLPCA、CLP、2-O-CLP、
CLP、2-O-CLP、CLPTM-D 和内标的保留时间分别为 CLPTM-D 对照品溶液，每个浓度平行制备 5 份，进行
2.01、3.32、2.83、2.68、1.87 min，且色谱峰峰形良好，基线 LC-MS/MS 分析，测得待测物的峰面积 A’，以 A/A’×
平稳，血浆内源性物质及其他杂质不干扰内标和待测成 100％计算基质效应。结果显示，CLPCA、CLP、2-O-CLP
分的测定，表明方法专属性良好。LC-MS/MS法的色谱 和 CLPTM-D 的基质效应在 90.3％～98.7％之间，CV
图见图2。 均＜7％（n＝5），表明在本方法色谱条件与质谱条件下
2.5 线性关系与定量下限考察 可忽略基质效应的影响。基质效应结果见表3。
取“2.2.1”项 下 不 同 质 量 浓 度 的 CLPCA、CLP、 2.8 稳定性考察
2-O-CLP、CLPTM-D 标准血浆样品，按“2.2.3”项下方法 按“2.6”项下方法配制低、高质量浓度的 CLPCA、
处理后，分别进行LC-MS/MS分析。以血浆中待测物质 CLP、2-O-CLP、CLPTM-D质控样品，每个浓度平行制备
量浓度为横坐标（x），待测物与内标的峰面积比值为纵 5份，按“2.2.3”项下方法处理后，考察室温（25 ℃）放置4
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