Page 72 - 2019年11月第30卷第21期
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通过羧酸酯酶（主要受CES1基因调控）水解为不具抗血                         1 材料
        小板活性的代谢产物——氯吡格雷羧酸代谢物（Clopi-                        1.1 仪器
        dogrel carboxylic acid，CLPCA），余下约15％在细胞色素              LC-30 AD 超高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公
        P450酶的作用下依次生成中间代谢产物——2-氧-氯吡格                       司）；AB SCIEX Qtrap 5500 三重四级杆串联质谱仪（包
        雷（2-oxo-clopidogrel，2-O-CLP）和活性代谢产物——氯             括电喷雾离子源）和 Analyst 1.4.2 数据分析软件（美国
        吡 格 雷 硫 醇 代 谢 物（Clopidogrel thiol metabolite，      AB Sciex 公司）；Legend Micro 17R 冷冻离心机（美国
        CLPTM），CLPTM可选择性地与血小板膜表面腺苷二磷                       Thermo 公司）；Vortex-Genie 2 涡旋振荡器（美国 Scienti-
                                            [1]
        酸受体P2Y12结合从而抑制血小板的聚集 。                             fic 公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水机（美国 Milli-
            药物体内代谢过程可能直接影响药物疗效的发                           pore公司）；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）。
          [2]
        挥 。活性代谢产物CLPTM由于含有巯基极易被氧化，                         1.2 药品与试剂
                                            [3]
        直接测定存在较大难度。Takahashi M 等 利用衍生化                         CLP 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：
        试剂 2-溴-3’-甲氧基苯乙酮（2-bromo-3’-methoxyaceto-          100819-201605，纯度：99％）；2-O-CLP 对照品（批号：
        phenone，BMP）将 CLPTM 转化为相对稳定的硫醇代谢                   2-GAB-58-1，纯 度 ：98％）、CLPCA 对 照 品（批 号 ：
        物 衍 生 物（Derivatized clopidogrel thiol metabolite，  3-YHU-79-2，纯 度 ：98％）和 CLPTM 对 照 品（批 号 ：
        CLPTM-D）后再测定其浓度，本研究也将采用此方法测                        2-RIT-52-1，纯度：95％）均购于加拿大TRC公司；噻氯吡
        定CLPTM的浓度。                                         啶对照品（批号：BCBK5476V，纯度：99％）和衍生化试
            目前国内外学者建立了多种 CLP 血药浓度检测方                       剂BMP（批号：STBF4711V，纯度：98％）均购自美国Sig-
        法 ，如 文 献 [4-5] 检 测 了 CLP，文 献 [6-7] 检 测 了           ma 公司；氯吡格雷片（深圳信立泰药业股份有限公司，
        2-O-CLP，文献[8-9]检测了 CLPTM，文献[10-13]检测               批号：B190001，规格：75 mg）；水为超纯水，乙腈和甲酸
        CLP 及其 1～2 种代谢产物。但是这些研究均没有一并                       为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
        检测 CLP 及代谢产物 CLPCA、2-O-CLP、CLPTM 的浓                1.3  受试者来源
        度，以至于难以完全阐明 CLP 的体内代谢过程。因此，                            本研究经陆军军医大学第一附属医院伦理委员会
        本研究将建立液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定                       审查批准，所有受试者均自愿参加并签署了知情同意
        人血浆中CLP及代谢产物CLPCA、2-O-CLP、CLPTM的                   书。经过严格筛选，选取90名确诊为脑卒中的患者参加
        浓度，以期为CLP临床给药方案调整提供精准的数据支                          试验，受试者年龄为 42～75 岁，半年内无内脏出血性疾
        撑。CLP 的体内代谢途径及 CLPTM 的衍生化过程见                       病史，无严重肝、肾、心或其他疾病。
        图1。                                                2 方法与结果
                                                           2.1  CLPTM-D的制备
                           CES1基因                          2.1.1  衍生方法      在Takahashi M等 研究的基础上，对
                                                                                           [3]
                                                           CLPTM的衍生化方法进行微调。用乙腈配制得到质量
              CLP                         CLPCA
                                                           浓度为 2.5 mg/mL 的 CLPTM 对照品溶液，取 0.5 mL 置
         细胞色素
          P450酶                                            于25 mL量瓶内，加入4 mL氯化铵溶液（100 mmol/L）和
                                                           0.5 mL BMP乙腈溶液（100 mmol/L），室温下放置10 min
                         细胞色素P450酶
                                                           后，用乙腈定容后得到CLPTM-D溶液，测得其质量浓度
               2-O-CLP                    CLPTM            为50 μg/mL。
                                                           2.1.2 CLPTM-D的鉴定与纯度测定             将“2.1.1”项下衍
                                                           生成的 CLPTM-D 溶液用乙腈稀释至 100 ng/mL 后进行
                                                           LC-MS/MS 分析，采用峰面积归一法计算，得到衍生物
                                                 BMP       CLPTM-D的纯度为96.8％，满足定量分析要求。
                                                           2.2 溶液的制备
                         CLPTM-D
                                                           2.2.1  标准血浆样品的制备            取 CLP、CLPCA 和 2-O-
           注：＊代表手性中心
                                                           CLP对照品和CLPTM-D溶液适量，用乙腈溶解后得到4
           Note：＊ means chiral center
         图1   CLP的体内代谢途径及CLPTM的衍生化过程                       种待测物的贮备液。分别取贮备液适量，用空白血浆稀
        Fig 1  The in vivo metabolic process of CLP and the  释至标准曲线所需浓度，其中CLPCA的质量浓度分别为
              derivation of CLPTM                          100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL，CLP的质


        中国药房    2019年第30卷第21期                                             China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 21  ·2947  ·
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