Page 59 - 《中国药房》2026年9期
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沉积。参考《药理实验方法学》（第4版）中人与小鼠等效                        （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通
          剂量换算方法，设定益肝化瘀方低、高剂量组小鼠的给                           路富集分析。以 P＜0.05 为显著富集标准，根据 3 组小
          药剂量分别是临床等效剂量的 1、2 倍，即分别为 28.98、                    鼠KEGG通路富集分析得到的P值，采用层次聚类分析
          57.96 g/kg（以生药量计）。于造模第3周开始给药干预，                    方法，使用 R 语言（版本 4.4.1）的 pheatmap 包绘制热图。
          益肝化瘀方各剂量组小鼠灌胃相应药液，空白组和模型                           利用String数据库（http：//string-db.org/）进行差异蛋白的
          组小鼠则灌胃等体积生理盐水，灌胃体积为 10 mL/kg，                      互作分析，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-
          每天1次，连续给药4周。                                       protein interaction，PPI）。综合 KEGG 通路富集分析、层
          2.3 取材及肝脏指数测定                                      次聚类分析与 PPI 分析结果，识别与肝纤维化密切相关
              末次给药结束24 h后取材。取材前称取小鼠体重，                       的信号通路及核心差异蛋白。
          并且取材前12 h小鼠禁食不禁水。腹腔注射2%戊巴比                         2.7 肝组织中核心差异蛋白表达检测
          妥钠（0.035 g/kg）将小鼠麻醉，摘取眼球取血，血样在室                    2.7.1 蛋白免疫印迹法检测
          温下静置 30 min 后，以 3 000 r/min 离心 15 min，收集血
                                                                 采用蛋白免疫印迹（Western blot，WB）法进行检测。
          清。剖取小鼠肝脏，称质量并计算肝脏指数（肝脏指
                                                             取“2.3”项下冻存的小鼠肝组织样本（每组随机取3个），
          数＝肝脏质量/体重×100%）。将部分肝组织置于4%多
                                                             提取组织中总蛋白，采用 BCA 法对总蛋白进行定量分
          聚甲醛中固定，用于后续病理学观察；剩余肝组织冻存
          于－80 ℃冰箱中，备用。                                      析，然后进行变性处理。取变性蛋白，上样进行 SDS-
          2.4 肝组织病理学观察                                       PAGE 电泳，大分子蛋白（分子量为 200～400 kDa）在
              采用苏木精-伊红（HE）染色法观察肝组织基本结构                       300 mA 恒流冰浴条件下转印 120 min，中、低分子蛋白
          变化；采用天狼星红染色法观察肝组织胶原纤维的分布                          （分子量为30～70 kDa）在200 mA恒流冰浴条件下转印
          与沉积情况，以评估肝纤维化程度。取“2.3”项下固定的                        60 min。转膜后经 5% 脱脂牛奶封闭 1 h，随后在 4 ℃下
          小鼠肝组织，经梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋后，使用                          与相应一抗（COL4A1、LAMA5、SPARC、VTN、GAPDH、
          切片机连续切片（厚 5 μm）。切片分别常规进行 HE 染                      β-tubulin，稀释度均为1∶1 000）孵育过夜；洗膜后与相应
          色和天狼星红染色，染色后的切片经脱水、透明、封片                           二抗（稀释度均为 1∶5 000）在室温下孵育 1 h。经 ECL
          后，置于显微镜下观察并采集图像。各组随机选取5张                           显影后，使用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白
          天狼星红染色切片进行观察，每张切片随机选取5个不                           与对应内参蛋白条带的灰度值比值表示目的蛋白的表
          重叠视野（视野直径为 200 μm），使用 Image J 软件识别                 达量。
          红色阳性区域，计算胶原阳性面积占视野总面积的百分                           2.7.2 免疫组化法检测
          比，取平均值作为该样本的胶原面积分数。                                    采用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法进行
          2.5 分子生物学指标检测                                      检测。取“2.4”项下小鼠肝组织石蜡切片（每组随机取3
          2.5.1 血清中肝功能指标检测                                   份），经常规脱蜡、梯度乙醇水化、柠檬酸盐缓冲液高温
              取“2.3”项下小鼠血清样本，根据生化试剂盒说明书                      高压抗原修复后，以3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，然
          方法操作，采用全自动生化仪检测血清中ALT、AST活性。                       后以山羊血清封闭 1 h。滴加一抗（COL4A1、LAMA5、
          2.5.2 肝组织中HYP含量检测
                                                             SPARC、VTN，稀释度均为 1∶1 000），在 4 ℃下孵育过
              准确称取“2.3”项下冻存的小鼠肝组织，加入生理盐
                                                             夜；洗膜后加入相应二抗（稀释度均为1∶5 000），室温孵
          水于冰上进行机械匀浆，取上清液，按照试剂盒说明书
                                                             育 1 h。经 DAB 显色、苏木精复染、脱水透明、封片后。
          方法操作，检测肝组织中HYP含量。                                  采用显微镜观察 ECM 及肝窦周围阳性染色情况，阳性
          2.6 肝组织的蛋白质组学分析                                    信号强度根据着色深浅分为弱阳性（淡黄色）、中度阳性
          2.6.1 蛋白质提取及差异蛋白筛选                                                                        ®
              取“2.3”项下空白组、模型组和益肝化瘀方高剂量组                     （棕黄色）、强阳性（棕褐色）。采用Aipathwell 数字病理
         （该组治疗效果更为显著，故本研究选取该组样本进行                            图像分析软件对全切片进行扫描及定量分析，以组织化
                                                             学评分（histochemistry score，H-score）进行半定量分析。
          蛋白质组学检测）小鼠冻存的肝组织样本（每组随机取3
                                                             H-score＝弱阳性面积（%）×1+中度阳性面积（%）×2+
          个），送至上海伟寰生物科技有限公司完成蛋白质组学                                            [8]
          检测。蛋白鉴定以错误发现率（false discovery rate，                强阳性面积（%）×3 。
          FDR）≤1%为阈值，以表达倍数变化（fold change，FC）≥                2.8 统计学分析
          1.2（表示上调）或≤0.83（表示下调）且校正后P＜0.05为                       采用 GraphPad Prism 10.5 软件进行统计分析及绘
          差异蛋白筛选标准 。筛选出的差异蛋白用于后续生物                           图。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较
                          [7]
          信息学分析。                                             采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验；不
          2.6.2 差异蛋白的生物信息学分析及筛选                              符合正态分布的计量资料以M（P25，P75 ）表示，多组间比较
              对筛选得到的差异蛋白进行基因本体（gene onto-                    采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi
          logy，GO）功能注释以及京都基因和基因组百科全书                         检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2026年第37卷第9期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 9    · 1157 ·
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