Page 45 - 《中国药房》2026年9期
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1.3 主要仪器                                               Masson染色：另取“2.3”项下每组6只小鼠心肌组织
              7100 型全自动生化分析仪、HITACHI-7650 型透射                的石蜡切片，经脱蜡、水化处理后，依次用苏木精染液、
          电镜均购自日本 Hitachi 公司；LV100POL/50IPOL 型光              丽春红-酸性复红混合液染色，再经磷钼酸溶液分化，最
          学显微镜购自日本Nikon公司；EVOS FL型全自动细胞                      后以苯胺蓝复染。染色完成后，按常规流程进行脱水、
          成像系统购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；Mini          透明及封片操作，借助光学显微镜观察小鼠心肌组织的
                   ®
          PROTEAN Tetra Cell 型电泳槽、UNHOOD Ⅱ型凝胶成               纤维化程度（胶原纤维呈蓝色，肌纤维等其他成分呈
          像系统购自美国 Bio-Rad 公司；卓越型血糖仪及配套的                      红色）。
          卓越金锐血糖试纸购自德国Roche公司。                               2.6 小鼠心肌细胞超微结构观察
          2 方法                                                   取“2.3”项下各组小鼠心肌组织的石蜡切片，经
          2.1 造模、分组与干预                                       2.5%戊二醛与1%锇酸双重固定、丙酮梯度脱水后，以环

              小鼠适应性喂养1周后，随机选取6只作为对照组，                        氧树脂包埋并完成聚合；随后使用超薄切片机切片，经
          饲喂普通饲料；剩余24只小鼠给予高糖高脂饲料喂养4                          醋酸铀与柠檬酸铅双重染色后，采用透射电镜观察小鼠
          周，造模前禁食 12 h，随后经尾静脉注射 STZ 溶液（100                   心肌细胞的超微结构。
          mg/kg）。72 h后，从小鼠尾静脉取血测定空腹血糖（fasting                2.7 小鼠心肌细胞死亡检测
          blood glucose，FBG），当 FBG＞11.1 mmol/L 时，判定为             取“2.3”项 下 小 鼠 心 肌 组 织 的 石 蜡 切 片 ，采 用
                            [10]
          糖尿病小鼠造模成功 。将造模成功的 24 只小鼠随机                         TUNEL 染色试剂盒进行染色。首先对完成脱蜡、水化
          分为模型组及 DMDD 低、中、高剂量组（12.5、25、50                    处理的切片进行蛋白酶消化，随后用磷酸盐缓冲液彻底
          mg/kg，剂量根据本课题组前期预实验结果设置，助溶剂                        冲洗；按试剂盒说明书推荐比例将TdT酶与荧光标记液
          为吐温-80），每组 6 只。DMDD 各剂量组小鼠每天上午                     充分混匀，滴加至切片表面，于37 ℃避光条件下孵育60
          空腹灌胃相应药液，模型组与对照组小鼠灌胃等体积生                           min。孵育结束后，使用 DAPI 对细胞核复染，在荧光显
          理盐水，灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续21 d。                    微镜下观察（死亡细胞的细胞核呈红色荧光信号）；随机
          2.2 小鼠血糖测定                                         选取5个视野，统计死亡细胞数，并计算死亡指数（死亡
              末次给药后，通过尾尖采血法采集小鼠微量全血样                         指数＝死亡细胞数/总细胞数×100%）。
          本，使用血糖仪及配套试纸检测其 FBG 水平，以评估药                        2.8 小鼠心肌组织中NCOA4蛋白阳性表达检测
          物的干预效果。                                                采用免疫组化法检测。取“2.3”项下各组小鼠心肌
          2.3 样本采集                                           组织的石蜡切片，先进行脱蜡、水化处理，随后使用柠檬
              尾尖采血结束后，采用异氟烷吸入法对小鼠进行麻                         酸钠缓冲液开展抗原修复；依次用 3% 过氧化氢溶液与
          醉，随后通过眼球摘除术采集血液样本。采集后的血液                           5% 牛血清白蛋白溶液对切片进行封闭处理后，滴加稀
          在室温下静置1 h，待其自然凝固分层后，于4 ℃条件下                        释比例为1∶1 000的NCOA4一抗，置于4 ℃条件下孵育
          以 3 000 r/min 离心 15 min。分离得到的血清转移至离                过夜。待切片经磷酸盐缓冲液洗涤后，滴加稀释比例为
          心管中，置于－80 ℃冰箱保存，以备后续各项生化指标                         1∶5 000 的二抗，于室温下孵育；经 DAB 显色、苏木精复
          检测。处死各组小鼠，取部分心脏组织立即浸入 4% 甲                         染后，用中性树胶封片。采用光学显微镜观察，每张切
          醛溶液中固定，经标准石蜡包埋处理后制备切片，用于                           片随机选取5个不重叠的高倍视野（400×），通过Image
          HE染色、Masson染色、TUNEL染色、免疫组化分析及透                     J软件进行分析：将图像转换为灰度模式，设定统一阈值
          射电镜观察；剩余心脏组织迅速放入液氮中速冻，随后                           以识别阳性区域，测量积分光密度值和区域总面积，并
          转移至－80 ℃冰箱保存，用于后续Western blot实验。                   计算阳性指数。阳性指数＝积分光密度值/区域总面
          2.4 小鼠心肌损伤指标检测                                     积×100%，以此反映NCOA4蛋白的阳性表达量。
              取“2.3”项下每组6只小鼠血清适量，严格按照试剂                      2.9 小鼠心肌组织中NCOA4/FTH1/ATG8轴相关蛋白
          盒说明书方法操作，采用比色法或酶联免疫吸附测定法                           表达检测
          测定血清中LDH、CK-MB水平。                                      采用Western blot法检测。取“2.3”项下各组小鼠冻
          2.5 小鼠心肌病理变化及纤维化程度观察                               存的心肌组织适量，加入含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解
              HE 染色：取“2.3”项下每组 6 只小鼠心肌组织的石                   液，在冰浴条件下充分匀浆；随后于4 ℃条件下离心，收
          蜡切片，经脱蜡、水化处理后进行 HE 染色，随后采用光                        集上清液，采用 BCA 法测定总蛋白浓度。将蛋白样品
          学显微镜观察小鼠心脏组织的病理变化。                                 变性处理后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电


          中国药房  2026年第37卷第9期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 9    · 1143 ·
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