Page 39 - 《中国药房》2026年9期
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育 30 min 后，用 PBS 漂洗 2～3 次，收集沉淀并用新的                 准称取“2.4.2（1）”项下冻存的肝组织适量，后续检测步
          Buffer 重悬。以未加探针的细胞作为阴性对照，上机检                       骤同“2.3.3”项下，引物序列及扩增产物长度见表 1。⑥
          测并统计平均荧光强度，荧光强度越强表示细胞内ROS                          肝组织中 Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表达检测——采用
          水平越高，提示细胞内氧化应激水平越高。                                Western blot法检测。精确称取“2.4.2（1）”项下冻存的肝
          2.4 动物实验                                           组织适量，提取组织中总蛋白并使用 BCA 试剂盒检测
          2.4.1 Eh-ENVs对正常小鼠肝脏的安全性评价                         其浓度。取等量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳并转膜，以
             （1）分组、给药与取材：实验设置正常组（NC组，n＝                      5% 脱脂牛奶封闭后，于特定的一抗（Nrf2、HO-1、NQO1
          6）和 Eh-ENVs 组（n＝4）。Eh-ENVs 组小鼠尾静脉注射                的稀释度均为1∶1 000，β-actin的稀释度为1∶5 000）中孵
          4 mg/kg的Eh-ENVs（剂量参考前期预实验结果设置，下                    育过夜，然后用特异性二抗进行印迹。采用化学发光液
          同），每天 1 次，持续 7 d。末次给药后，小鼠禁食不禁水                     显影后采集图像，采用 Image J 软件分析目的条带灰度
          过夜，用戊巴比妥钠麻醉小鼠后摘眼球取血，然后颈椎                           值，以目的蛋白与内参（β-actin）蛋白条带灰度值的比值
          脱臼处死小鼠，立刻取心、肝、脾、肺、肾组织。将心、脾、                        表示目的蛋白的表达量。
          肺、肾组织和部分肝组织置于4%多聚甲醛中固定，剩余                          2.5 统计学方法
          肝组织置于－80 ℃冰箱中保存备用。血液在室温静置                              采用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计分析和制
          1 h后，在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，取上清液，置
                                                             图。经 Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的数据以 x±s
          于－80 ℃冰箱中保存备用。
                                                             表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，两
             （2）指标检测：①血清生化指标检测——取“2.4.1
                                                             样本间比较采用独立样本 t 检验；不符合正态分布的数
         （1）”项下血清（每组取4只小鼠血清样本），按照试剂盒
                                                             据以 M（P25，P75 ）表示，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H
          说明书方法操作，检测血清中 AST、ALT、Urea 和 Cr 水
                                                             检验（非参数检验），组间两两比较采用Dunn检验（Bon‐
          平。②组织病理形态学观察——取“2.4.1（1）”项下经
                                                             ferroni校正）。检验水准α＝0.05。
          4% 多聚甲醛固定的心、肝、脾、肺、肾组织，常规制备石                        3 结果
          蜡切片（厚 5 μm），并进行常规 HE 染色，通过病理切片
                                                             3.1 Eh-ENVs的提取和表征结果
          扫描仪观察各组织病理形态学变化。
                                                                 本研究从 500 g 新鲜全草中约提取到 20 mg Eh-
          2.4.2 Eh-ENVs改善APAP诱导肝损伤的药效作用及机
                                                             ENVs。Eh-ENVs 的平均粒径为 179.2 nm，多分散指数
          制研究
                                                             为 0.347；表面呈负电荷，Zeta 电位为－15.9 mV；呈现典
             （1）分组、造模、给药与取材：实验设置 NC 组[小鼠
                                                             型的圆盘状（具体表征结果请扫描本文首页二维码，进
          同“2.4.1（1）”项下]、APAP 组和 Eh-ENVs 组，每组 6 只。
                                                             入“增强出版”页面查看附图1）。
          Eh-ENVs 组小鼠每天尾静脉注射 4 mg/kg 的 Eh-ENVs，
                                                             3.2 细胞实验结果
          NC组和APAP组小鼠每天尾静脉注射等体积无菌PBS，
                                                             3.2.1 Eh-ENVs对两种细胞的毒性评价结果
          每天 1 次，持续 7 d。第 7 天给药 1 h 后，NC 组小鼠腹腔
                                                                 如图1所示，在0～100 μg/mL质量浓度范围内，Eh-
          注射等体积生理盐水，其余2组小鼠腹腔注射200 mg/kg
          APAP诱导肝损伤      [13―14] 。造模后小鼠禁食不禁水24 h，然           ENVs 对 RAW264.7 和 AML12 细 胞 的 增 殖 几 乎 没 有
                                                             影响。
          后按“2.4.1（1）项下”方法获取肝组织和血清样本。
             （2）指标检测：①血清生化指标检测——取处理好                                150                   160
          的血清，按照相应试剂盒说明书方法检测血清中AST和                                细胞活力/%  100           细胞活力/%  120
                                                                                          80
          ALT水平。②肝组织病理形态学观察——取“2.4.2（1）”                            50                    40
          项下经4%多聚甲醛固定的肝组织，按照“2.4.1（2）”项下                             0                     0
                                                                       0    5  10  25  50 100  0    5  10  25  50 100
          方法操作，观察肝组织的病理形态学变化。③肝组织中                                     质量浓度/（μg/mL）          质量浓度/（μg/mL）
          TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA 表达——采用 RT-qPCR 法                       A. AML12细胞          B. RAW264.7细胞
                                                             图1 不同质量浓度 Eh-ENVs 对 AML12 和 RAW264.7
          检测（每组取 4 个样本）。称取“2.4.2（1）”项下冻存的肝
                                                                  细胞的毒性评价结果（x±s，n＝4）
          组织适量，后续检测步骤同“2.3.3”项下，引物序列及扩
          增产物长度见表1。④肝组织中氧化应激指标检测——                           3.2.2 Eh-ENVs 对 RAW264.7 细胞中炎症因子 mRNA
          称取“2.4.2（1）”项下冻存的肝组织适量，研磨破碎后得                      表达的影响
          到组织匀浆，离心取上清后使用BCA试剂盒进行定量。                              与正常组比较，模型组细胞中TNF-α、IL-1β mRNA
          根据试剂盒说明书方法操作，测定肝组织中 MDA 和                          表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，Eh-
          SOD 水平。⑤肝组织中 Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA 表达                ENVs 低、高浓度组细胞中 TNF-α、IL-1β mRNA 表达水
          检测——采用 RT-qPCR 法检测（每组取 4 个样本）。精                    平均显著降低（P＜0.05）。结果见表2。


          中国药房  2026年第37卷第9期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 9    · 1137 ·
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