Page 38 - 《中国药房》2026年9期
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证号：SYXK（粤）2023-0327]，饲养环境温度为（22±                    成新鲜完全培养基，将 Eh-ENVs 低、高浓度组的培养基
          1）℃、自然昼夜节律。饲养期间小鼠自由饮水与进食。                           换成含有10 μg/mL或20 μg/mL Eh-ENVs的完全培养基
          本研究动物实验已获深圳华腾生物医药科技有限公司                            （药物浓度根据预实验结果设置），继续培养24 h。培养
          实验动物使用与管理委员会批准，批号为B202510-5。                        结束后，用 PBS 清洗细胞数次，在 4 ℃下以 1 000 r/min
          1.4 细胞                                              离心5 min后弃上清，收集细胞沉淀。
              本研究所用的巨噬细胞 RAW264.7 和 AML12 均购                  2.3.3 RAW264.7细胞中炎症因子mRNA表达检测
          自武汉赛维尔生物科技有限公司。                                         采用 RT-qPCR 法检测细胞中 TNF-α、IL-1β mRNA
          2 方法                                                表达。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔
          2.1 Eh-ENVs的分离、纯化与表征                                板中，按“2.3.2”项下方法分组、给药、培养并收集细胞沉
              参考既往研究       [11―12] ，并进行条件优化后制备 Eh-            淀。采用Trizol试剂提取细胞中总RNA，检测其纯度和
          ENVs。将新鲜大飞扬草全草 500 g 榨汁过滤后得粗滤                       浓度后，将 RNA 逆转录合成 cDNA，并以 cDNA 为模板
          液，取粗滤液于离心管中，在 4 ℃下以 4 000 r/min 离心                  进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变
          30 min，弃大颗粒杂质；取上清液转入新离心管，再在                         性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，40个循环。反应
          4 ℃下以 12 000 r/min 离心 30 min，弃小颗粒杂质；上清              体系（共20 μL）为：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游
          液依次经 0.8、0.45、0.22 μm 滤膜过滤后转入超速离心                   引物各 0.4 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。以
          管，在 4 ℃下以 150 000×g 离心 90 min，弃上清液，得到               Gapdh 作为内参，采用 2      －ΔΔCt 法计算各目的基因 mRNA
          纯化后的 Eh-ENVs，并用 BCA 试剂盒测定样本中总蛋                      的相对表达量。引物序列及扩增产物长度见表1。
          白浓度。将提纯后的Eh-ENVs进行分装，各取10 μL分                                 表1 引物序列及扩增产物长度
          别用于粒径、Zeta电位与形貌表征；其中，形貌通过透射                         目的基因          序列（5′→3′）               扩增产物长度/bp
          电镜检测，粒径与Zeta电位通过动态光散射检测。剩余                          Gapdh         上游：CAGGAGCGAGACCCCACTAA    146
                                                                            下游：ATCACGCCACAGCTTTCCAG
          样品储存于－80 ℃冰箱中，备用。                                   Tnf-α         上游：CTATGGCCCAGACCCTCACA    116
          2.2 细胞培养                                                          下游：TCTTGACGGCAGAGAGGAGG
              RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-链                     Il-1β         上游：AGCTGGAGAGTGTGGATCCC    131
                                                                            下游：CCTGTCTTGGCCGAGGACTA
          霉素溶液（50 U/mL 青霉素+50 U/mL 链霉素，下同）的
                                                              Il-10         上游：TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC  125
          DMEM 培养基培养；AML12 细胞用含 10% 胎牛血清、                                   下游：GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG
          1%青霉素-链霉素溶液、0.5%转铁蛋白和0.01%地塞米                       Nrf2          上游：TAGATGACCATGAGTCGCTTGC  153
                                                                            下游：GCCAAACTTGCTCCATGTCC
          松（40 ng/mL）的DMEM/F-12培养基培养。培养参数设
                                                              Ho-1          上游：AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA   177
          定为 37 ℃恒温、5%CO2及饱和湿度。当细胞生长密度                                      下游：GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA
          达70%～80%时用于后续实验。                                    Nqo1          上游：AGGATGGGAGGTACTCGAATC   151
          2.3 细胞实验                                                          下游：TGCTAGAGATGACTCGGAAGG
          2.3.1 Eh-ENVs对细胞的毒性评价                               2.3.4 RAW264.7细胞对Eh-ENVs的摄取能力考察
              采用 CCK-8 法检测。将 RAW264.7 和 AML12 细胞                  采用流式细胞术检测。将 0.5 mg/mL Eh-ENVs 与 1
          分别接种于96孔板中，设置调零孔（只含培养基不含细                           mmol/L DiD染料按照1 000∶1（V/V）的比例混合均匀，搅
          胞）、空白对照孔（只含细胞不给药）和实验组。实验组                           拌过夜；在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 60 min 去除游离
         （每组设置 4 个复孔）分别用 5、10、25、50、100 μg/mL 的               染料，所得沉淀用 PBS 重悬，即得 DiD@ENVs。取培养
          Eh-ENVs 处理细胞 24 h 后，弃掉培养基；用磷酸盐缓冲                    状态良好的RAW264.7细胞接种于6孔板中，常规培养，
          液（PBS）清洗细胞，加入 10 μL CCK-8 试剂和 90 μL 无               待其贴壁后，除去原培养基，用PBS漂洗细胞；将培养基
          血清基础培养基，孵育0.5～1 h，然后用微孔板分光光度                        换成含有10 μmol/L DiD@ENVs的无血清培养基，继续
          计测定450 nm波长处的吸光度，并计算细胞活力。细胞                         共孵育0、3、6、9、12 h。孵育结束后，除去培养基，用PBS
          活力（%）＝（实验组吸光度－调零孔吸光度）/（空白对照                         洗涤细胞3次，收集细胞。用冷PBS重悬细胞后，上机检
          孔吸光度－调零孔吸光度）×100%。                                  测并统计荧光强度，荧光强度越强表示细胞对Eh-ENVs
          2.3.2 细胞分组与给药                                       的摄取能力越强。
              将处于对数生长期的 RAW264.7 细胞分为正常组、                     2.3.5 RAW264.7细胞中ROS水平检测
          模型组和 Eh-ENVs 低、高浓度组，每组设置 3 个复孔。                         采用流式细胞术检测。将 RAW264.7 细胞接种于 6
          除正常组外，其余各组均加入1 μg/mL脂多糖（lipopoly‐                   孔板中，按“2.3.2”项下方法分组、给药、培养并收集细胞
          saccaride，LPS）刺激细胞1 h以构建炎症细胞模型（模拟                   沉淀。细胞沉淀用含有 DCFH-DA 探针的培养基重悬
          APAP诱导的肝损伤过程）。而后，将模型组的培养基换                          [将探针和基础培养基按 1∶1 000（V/V）的比例混合]，孵


          · 1136 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 9                              中国药房  2026年第37卷第9期
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