Page 42 - 《中国药房》2026年8期
P. 42

理委员会批准，编号：（齐医）动审【2023】79 号（QMU-                     1∶1）混合液中浸透，以纯树脂包埋，制备超薄切片，贴附
          AECC-2023-79）。                                      于铜网上；用醋酸铀染色 20 min、枸橼酸铅染色 15 min
          2 方法与结果                                             后，置于透射电子显微镜下观察超微结构。
          2.1 分组、造模与给药                                        2.6 脑组织中TH阳性表达检测
              将 50 只小鼠随机分为正常对照组、模型组、ELB 低                         取“2.3”项下每组随机 6 只小鼠脑组织，用 4% 福尔
          剂量组（80 mg/kg）、ELB高剂量组（160 mg/kg）和阳性对                马林溶液固定 24 h，然后进行程序脱水、包埋、切片，按
          照组（盐酸司来吉兰片，10 mg/kg），每组10只，ELB给药                    照 DAB 免疫组化试剂盒说明书操作，于倒置显微镜下
          剂量根据前期预实验结果设定，盐酸司来吉兰片剂量根                            观察并拍照，利用 Image J 软件分析棕黄色颗粒（TH 阳
          据临床常用剂量换算。小鼠自由适应性喂养1周后开始                            性表达）的光密度（optical density，OD），结果以正常对照
          实验，从实验第 1 天起，各给药组小鼠每天灌胃相应溶                          组数值为标准进行归一化处理。
          液，正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水，给药体积                            2.7 脑组织中蛋白表达检测
          为 0.4 mL，连续 14 d。从实验第 10 天起，模型组和各给                      从“2.3”项下每组随机6只小鼠脑组织中提取蛋白，
          药组小鼠腹腔注射 MPTP 30 mg/kg，连续 5 d，诱导慢性                  测定浓度后，加热变性。取变性蛋白，电泳分离、转膜
                 [6]
          PD模型 ；正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.1 mL。                        后，用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h，加入 TH、α-syn、Iba-1、
          2.2 小鼠行为能力测试                                        p-IKKβ、IKKβ、p-NF-κB p65、Lamin B1 和 GAPDH 一抗
          2.2.1 转棒实验                                         （稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、
                                  [7]
              转棒实验根据相关报道 加以改进后开展。实验第                          1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000），于 37 °C 下孵育
          12 天每组随机选取 6 只小鼠进行行为学转棒训练。训                         4 h；TBST洗涤3次后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗
          练时，转棒疲劳仪的转速为15 r/min，每天训练120 s，连                   （稀释比例为1∶2 000）在37 ℃下孵育2 h；TBST洗涤后，
          续训练 3 d。末次给药 24 h 后进行正式测试，转棒疲劳                      加入ECL荧光检测剂，曝光显影后于一体式化学发光成
          仪的初始转速为4 r/min，最高转速为40 r/min，加速度为                   像仪内扫描分析条带灰度值。以p-IKKβ/IKKβ和p-NF-
          20 r/min，实验时间为 5 min，记录从旋转开始到小鼠离                    κB p65/Lamin B1 比值表示 IKKβ、NF-κB p65 蛋白的磷
          开杆的时间，作为转棒停留时间。每只小鼠测试3次，两                           酸化水平，其余以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰
          次测试间隔1 h，取均值，结果以正常对照组数值为标准                          度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          进行归一化处理。                                            2.8 脑组织中IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA表达检测
          2.2.2 爬杆实验                                              从“2.3”项下每组随机 6 只小鼠脑组织中提取总
              转棒实验结束后，选用长 50 cm、直径 1 cm 的木杆                   RNA，逆转录成 cDNA，并进行实时 PCR 扩增。PCR 反
          子，进行爬杆实验。记录每组随机6只小鼠通过杆子爬                            应体系总体积为 20 μL，包括 cDNA 模板 2 μL，dNTP 溶
          到地板上的时间，并根据攀爬时间进行评分：＞6 s 为 1                        液1.6 μL，正、反向引物各0.8 μL，BeyoTaq Buffer溶液2
                                    [6]
          分，3～6 s 为 2 分，＜3 s 为 3 分 。小鼠从杆子上掉落视                 μL，BeyoTaq DNA Polymerase 溶液 0.1 μL，用双蒸水加
          为无效。每只小鼠测完后，均用75%乙醇溶液清洁木杆                           至20 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性
          子。每只小鼠测试3次，取均值，结果以正常对照组数值
                                                              5 s、60 ℃退火延伸 31 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内
          为标准进行归一化处理。实验数据的最终产出环节（即                                     －ΔΔCt
                                                              参 ，采 用 2     法 计 算 脑 组 织 中 IL-1β、IL-10、TNF- α
          评分与分析阶段）严格采用“单盲”评估。
                                                              mRNA的相对表达量，并以正常对照组数值为标准进行
          2.3 样本采集
                                                              归一化处理。引物序列与扩增产物长度见表1。
              小鼠行为能力测试完成后，用乙醚麻醉并脱颈处
                                                                        表1 引物序列与扩增产物长度
          死，快速摘取脑组织，于冰上分离脑黑质，备用。
                                                              基因                 引物序列                扩增产物长度/bp
          2.4 脑组织中炎症因子水平检测                                    IL-1β      正向：5′- TGGTGTGTGACGTTCCC-3′   112
              取“2.3”项下每组随机6只小鼠脑组织，置于提前预                                  反向：5′- TGTCCATTGAGGTGGAGAG-3′
          冷的裂解液中冰浴30 min，以12 000 r/min离心5 min，取               TNF-α      正向：5′- GCAAAGGGAGAGTGGTCA-3′  128
                                                                         反向：5′- CTGGCTCTGTGAGGAAGG-3′
          上清液，按照 ELISA 试剂盒说明书操作，于酶标仪中检
                                                              IL-10      正向：5′- TTCACAAGTCGGAGGCTTA-3′  107
          测吸光度值，并计算IL-1β、IL-10、TNF-α水平，结果以正                              反向：5′- CAAGTGCATCATCGTTGTTC-3′
          常对照组数值为标准进行归一化处理。                                   GAPDH      正向：5′- CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′  113
          2.5 脑黑质组织超微结构观察                                                反向：5′- TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′
              取“2.3”项下每组随机6只小鼠部分脑黑质组织，置                       2.9 统计学分析
          于 2.5% 戊二醛溶液中，于 4 ℃固定过夜；次日取出并迅                          采用 SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析。采用
          速切至米粒大小，转移至EP管内，用0.1 mol/L磷酸盐缓                      Shapiro‑Wilk 检验进行正态性分析，呈正态分布的计量
          冲液洗涤3次；随后于4 ℃下以1%锇酸固定2 h，经梯度                        资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进
          乙醇逐级脱水后，置于环氧丙酮与环氧树脂（体积比为                            一步两两比较采用SNK检验。检验水准α＝0.05。


          · 1000 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 8                              中国药房  2026年第37卷第8期
   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47