Page 47 - 《中国药房》2026年8期
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30 min后，在培养皿中补加500 μL完全培养液，于37 ℃                   ELISA 试剂盒说明书操作，检测上清液中 IL-6、TNF-α
          培养箱中培养过夜。将经过上述处理的细胞分为正常                            水平。
                                                                     2+
          对照组和红花提取物组，每组设3个复孔（后同）。正常                          2.3.5 Ca 浓度检测
          对照组不做任何处理，红花提取物组加入10 μL终浓度                             取处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞制备成密度为
                                                                  5
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          为10 mg/mL的红花提取物[该浓度依据本课题组前期预                       2×10  mL 的细胞悬液，取 2 mL 该细胞悬液接种于 6
          实验筛选出的半数抑制浓度（half maximal inhibitory               孔板中，置于 37 ℃培养箱中培养过夜。将经过上述处
          concentration，IC50 ）设定]。继续培养24 h后，用磷酸盐缓            理后的细胞分为正常对照组和红花提取物组。正常对
          冲液漂洗3次，每次5 min；采用4%多聚甲醛溶液在室温                       照组加入2 mL完全培养基，红花提取物组加入2 mL含
          下处理20 min；再用双蒸水清洗3次，每次2 min；每孔加                    10 mg/mL 红花提取物的完全培养基。然后，将其置于
          入适量的细胞专用甲苯胺蓝染色液染色 5 min，随后加                        37 ℃培养箱中继续培养24 h。用胰蛋白酶消化细胞后，
          入等量蒸馏水，混匀后静置15 min；最后用蒸馏水清洗2                       用 Hank’s 平衡盐溶液洗涤 3 次，将细胞转移到 2 mL EP
          次，每次30 s，加入足量蒸馏水以完全浸没样本。采用倒                        管中，每管加入100 μL的Fluo-3 AM工作液，于37 ℃下
          置显微镜观察细胞形态变化并拍照。计数每200个细胞                          培养20 min，以此进行荧光探针装载。随后加入500 μL
          中染色的细胞数量，并计算细胞的脱颗粒率：脱颗粒率                           含1%胎牛血清的Hank’s平衡盐溶液，继续培养40 min。
         （%）＝染色细胞数/200个细胞数×100%。                             再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬细胞，制成密度为1×
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          2.3.2 组胺含量检测                                       10  mL 的细胞悬液，按每管200 μL分装后，于37 ℃培
              取处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞，接种于 12 孔                  养10 min。最后采用流式细胞仪检测平均荧光强度，以
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          板中，接种密度为 2×10  mL ，每孔接种体积为 1 mL，                   此反映 Ca 浓度，平均荧光强度越大，表明 Ca 浓度
                                                                                                       2+
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          随后将其置于培养箱中培养过夜。将经过上述处理后                            越高。
          的细胞分为正常对照组和红花提取物组。正常对照组                            2.4 超剂量红花提取物致敏血清对RBL-2H3细胞免疫
          加入1 mL完全培养基，红花提取物组加入1 mL含有10                       毒性的考察
          mg/mL红花提取物的完全培养基。然后，将其置于37 ℃                       2.4.1 超剂量红花提取物致敏给药剂量的设定
          培养箱中继续培养24 h，收集各组上清液。按照ELISA                           为系统评价红花在不同应用场景中的免疫毒性，本
          试剂盒说明书操作，检测上清液中的组胺含量。                              研究采用超剂量致敏给药方案，分析超剂量红花提取物
          2.3.3 β-氨基己糖苷酶释放率计算                                致敏血清诱导 RBL-2H3 细胞的免疫毒性。依据本课题
              取处于对数生长期的RBL-2H3细胞，接种于96孔板                     组前期研究结果，红花提取物配制后的最大使用浓度为
          中，接种密度为 1×10  mL ，每孔接种体积为 100 μL，                  2.04 g/mL，因此以此浓度作为超剂量致敏给药剂量。
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          随后将其置于培养箱中培养过夜。将经过上述处理后                            2.4.2 致敏血清的制备
          的细胞分为正常对照组和红花提取物组。正常对照组                                大鼠适应性喂养1周后，将大鼠分为正常对照组、佐
          加入 100 μL 完全培养基，红花提取物组加入 100 μL 含                  剂处理组、红花提取物诱导致敏组和OVA诱导致敏组。
          10 mg/mL 红花提取物的完全培养基。然后，将其置于                       正常对照组大鼠不做任何处理。佐剂处理组大鼠于背
          37 ℃培养箱继续培养 24 h，收集各组上清液。然后，在                      部皮下注射佐剂，每次1 mL，隔日1次，共3次（首次注射
          正常对照组原孔中加入50 μL细胞裂解液，于37 ℃孵育                       采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂）。红
          30 min。分别取各孔上清液以及正常对照组细胞裂解液                        花提取物诱导致敏组及OVA诱导致敏组大鼠，通过背部
          50 μL，转移至新的 96 孔板中，随后加入 100 μL 显色底                 皮下分别注射红花提取物或OVA与佐剂等体积混合的
          物，于37 ℃下孵育45 min。最后，加入200 μL终止液终                   乳剂来致敏，每次 1 mL，隔日 1 次，共 3 次[首次致敏时，
          止反应，于 405 nm 波长处测定吸光度（optical density，             分别将 0.5 mL 红花提取物（2.04 g/mL）或 0.5 mL OVA
          OD）值，并计算 β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，               （50 mg/mL）与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳剂后
          β-Hex）释放率：β-Hex释放率（%）＝各组受检孔上清OD                    进行注射；第2、3次致敏时，分别将上述浓度的红花提取
          值/（正常对照组上清 OD 值+正常对照组胞内 OD 值）×                     物和OVA溶液各0.5 mL，与等体积的弗氏不完全佐剂混
          100%。                                              合制成乳剂后进行注射]。在末次致敏后的第 13 天，将
          2.3.4 IL-6、TNF-α水平检测                               大鼠用7%水合氯醛麻醉，经腹主动脉取血，将血液置于
              取处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞，接种于 96 孔                  37 ℃水浴15 min，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，
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          板中，接种密度为1×10  mL ，每孔接种体积为100 μL，                   即为致敏血清。将致敏血清分装后，于－20 ℃保存
          随后将其置于培养箱中过夜培养。将经过上述处理后                            备用。
          的细胞分为正常对照组和红花提取物组。正常对照组                            2.4.3 细胞形态学观察及脱颗粒计数
          加入 100 μL 完全培养基，红花提取物组加入 100 μL 含                      取处于对数生长期的RBL-2H3细胞，经胰蛋白酶消
          10 mg/mL 红花提取物的完全培养基。然后，将其置于                       化处理后，采用完全培养基进行重悬，并将细胞密度调
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          37 ℃培养箱中继续培养 24 h，收集各组上清液，按照                       整至 2×10  mL 。于无菌 12 孔板中铺设细胞圆片，取
          中国药房  2026年第37卷第8期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 8    · 1005 ·
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