Page 44 - 《中国药房》2026年7期
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生产许可证号为 SCXK（浙）2020-0002。大鼠饲养于河                     孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药。常规培养
          南中模生物技术研究院，饲养环境温度为24 ℃、相对湿                          24 h后，收集细胞进行如下观察：（1）扫描电子显微镜观
          度为 50%、12 h 光/12 h 暗循环，饲养期间自由摄食和饮                   察——取出盖玻片，用2.5%戊二醛固定，然后用锇酸后
          水。本研究中动物实验方案已通过河南中模生物技术                             固定，并经梯度乙醇脱水、临界点干燥、喷金后，在扫描
          研究院实验动物伦理委员会批准[伦理编号：ZM（伦）                           电镜下观察细胞形态学特征；（2）相差荧光显微镜观察——
          202510010]。                                         直接观察各组细胞形态特征，记录是否出现焦亡相关形
          1.4 细胞                                              态改变。
              RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株（货号                      2.5 细胞中GSDMD-N蛋白的定位与表达检测
          CL-0190）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。本实验室                            采用免疫荧光法检测。将处于对数生长期的细胞
          按照标准流程进行细胞的常规培养、传代及冻存操作。                            接种于 12 孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药。
          2 方法                                                培养24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min；样本用快速封
          2.1 含药血清制备                                          闭液封闭，随后与 GSDMD-N 抗体（抗体浓度按产品说
              将 SD 大鼠随机分为空白组（5 只）和化痰祛湿活血                      明书配制）在4 ℃下孵育过夜；以磷酸盐缓冲液（PBS）清
          方组（25 只），先适应性喂养 7 d 后再进行正式实验。正                      洗细胞5次后，加入荧光二抗（抗体浓度按产品说明书配
          式实验中，化痰祛湿活血方组大鼠灌胃化痰祛湿活血方                            制），室温下避光孵育1 h；采用含DAPI的抗荧光淬灭封
                           [10]
          颗粒剂 15 g/（kg·d） ，空白组大鼠灌胃等体积去离子                      片剂避光孵育 5 min 后，将细胞置于倒置相差荧光显微
          水，每天灌胃1次，连续给药7 d。末次灌胃后1 h，经大鼠腹                      镜下观察并采集图像（阳性信号呈绿色荧光，与蓝色细
          主动脉采血。将血液在室温下静置 30 min 后，以 3 000                    胞核形成共定位，可直观反映GSDMD-N蛋白的亚细胞
          r/min离心15 min分离血清，经0.22 μm无菌滤膜过滤除                   定位）。采用Image J软件分析细胞中GSDMD-N蛋白的
          菌后，再以56 ℃水浴灭活30 min，分别得到含药血清和                       荧光强度，荧光强度越强，表明 GSDMD-N 蛋白表达水
          空白血清，分装后于－80 ℃环境下冻存，备用。                             平越高。
          2.2 含药血清对RAW264.7细胞增殖的影响考察                          2.6 细胞培养上清液中IL-1β、IL-18含量检测
              将 RAW264.7 细胞接种于 96 孔板中，每孔 5×10            3        采用 ELISA 法检测。取“2.3”项下各组细胞的上清
          个。将细胞分为对照组（不加含药血清）和 2.5%、5%、                        液，按 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪在 450 nm
          10%、15% 含药血清组，每组设置 3 个复孔；另设不含细                      波长下测定各孔的 OD 值，依据标准曲线计算细胞培养
          胞和药物的调零组。常规培养细胞，待其贴壁后，吸弃                            上清液中IL-1β、IL-18含量。
          培养基，加入含相应浓度血清的培养基，于 37 ℃、                           2.7 细胞中 NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表达
          5%CO2培养箱中继续培养 24 h 后，加入 CCK-8 溶液，继                  检测
          续培养 2 h。培养结束后，采用酶标仪检测 450 nm 波长                         采用real-time PCR法检测。取“2.3”项下各组细胞，
          处各孔的吸光度（OD）值，并计算细胞存活率。细胞存                           提取细胞中总 RNA，检测其浓度和纯度后，将其逆转录
          活率＝（加药组 OD 值－调零组 OD 值）/（对照组 OD                      合成 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体
                                                              系为：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix
          值－调零组OD值）×100%。
          2.3 细胞分组、造模与给药                                      10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 2.0 μL，无酶
                                                              水7.2 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，
              将细胞分为5组，其给药和造模情况如下：空白对照
                                                              60 ℃退火/延伸30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用
          组（Control组）——加入含10%空白血清的DMEM完全                       －ΔΔCt
          培养基；模型组（Model 组）——加入含 10% 空白血清的                     2   法计算细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD的mRNA
                                                              相对表达水平。PCR引物由湖南艾科瑞生物工程有限公
          DMEM 完全培养基+5 μg/mL LPS（诱导建立 RAW264.7
                          [9]
          巨噬细胞焦亡模型 ，下同）；低浓度含药血清组（HQHF-                        司设计并合成，具体引物序列及扩增产物长度见表1。
                                                                        表1 引物序列及扩增产物长度
          L组）——加入含2.5%含药血清+7.5%大鼠空白血清的
          DMEM 完全培养基+5 μg/mL LPS；中浓度含药血清组                     基因名称          引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
                                                              NLRP3         上游：GACCGTGAGGAAAGGACCAG     125
         （HQHF-M组）——加入含5%含药血清+5%大鼠空白血                                       下游：GGCCAAAGAGGAATCGGACA
          清的 DMEM 完全培养基+5 μg/mL LPS；高浓度含药血                    Caspase-1     上游：ACCCCAAACTCAAGGACACG     119
          清组（HQHF-H 组）——加入含 10% 含药血清的 DMEM                                  下游：CAGGGAGAAGTCGTCATCCG
                                                              GSDMD         上游：TGCGTGTGACTCAGAAGACC     108
          完全培养基+5 μg/mL LPS。每组设置 3 个复孔。各给
                                                                            下游：CAAACAGGTCATCCCCACGA
          药组含药血清的浓度根据“2.2”项下实验结果确定。各                          GAPDH         上游：GTTCCCACCCTAGAAAGTCCA    146
          组细胞均置于培养箱中常规培养24 h，培养结束后收集                                        下游：ACTTGGAGGAGGTTTGCTGG
          细胞及细胞培养上清液，用于后续指标检测。                                2.8 细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达检测
          2.4 细胞形态学观察                                             采用 Western blot 法检测。取对数生长期细胞，以
                                                                       5
              取对数生长期细胞，接种于预先放置有盖玻片的 6                         每孔2×10 个细胞的密度接种于6孔板中，按“2.3”项下

          · 866 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 7                               中国药房  2026年第37卷第7期
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