Page 34 - 《中国药房》2026年4期
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2.2 细胞实验                                            2.2.6 免疫相关炎症因子水平检测
          2.2.1 清热化痰活血方含药血清制备                                     收集“2.2.4”项下作用24 h的细胞上清液，按ELISA
              选取SPF级Wistar大鼠20只，随机分组为空白血清                     试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测 TNF-α、IL-1β
                                                              水平。
          组、清热化痰活血方组。空白血清组大鼠灌胃生理盐
                                                              2.3 动物实验
          水，清热化痰活血方组大鼠灌胃清热化痰活血方20 g/kg
                                                              2.3.1 AS模型构建与分组给药
         （按临床常用剂量换算），每次给药体积为 10 mL/kg，每
                                                                  将 ApoE －/－ 小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组
          日2次，连续5 d。于末次灌胃1 h后，腹腔注射戊巴比妥                       （2.6 mg/kg）和清热化痰活血方低、中、高剂量组（90、
          钠（45 mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置 30                      180、360 mg/kg，分别为临床常用剂量的 0.5、1、2 倍），每
          min，以 3 000 r/min 离心 15 min 分离血清，于 56 ℃水浴           组10只，予以高脂饲料喂养8周构建AS模型。将10只
          灭活补体30 min，经0.22 μm滤膜除菌，分装后于－80 ℃                   C57BL/6J 小鼠作为正常对照组，予以普通饲料喂养 8
          保存。                                                 周。然后，正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐
          2.2.2 巨噬细胞培养                                        水，给药组小鼠灌胃相应药物，每日1次，连续8周。
                                                              2.3.2 血清中炎症因子水平检测
              RAW264.7 细胞静置培养，待长至 85% 时进行扩增
                                                                  末次给药24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg
          传代。传代时，吸弃旧培养基，使用 0.25% 胰酶消化
                                                              麻醉小鼠，腹主动脉采血，分离血清，按ELISA试剂盒说
          30～60 s，再加入含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养                    明书操作，检测TNF-α、IL-1β水平。
          基，以300×g离心10 min，收集细胞沉淀，重悬后接种至                      2.3.3 主动脉病理学观察
               2
          25 cm 培养瓶中继续培养。培养期间每2～3 d更换一次                           小鼠采血后处死，分离主动脉，用PBS冲洗后，置于
          新鲜培养基，待细胞状态稳定后用于后续实验。                               4% 多聚甲醛中固定 48～72 h，先进行大体油红 O 染色，

          2.2.3 巨噬细胞活性检测                                      使用显微镜观察主动脉脂质沉积情况（以主动脉整体及
              将 RAW264.7 细胞接种至 96 孔板中，每孔 5×10            3    根部斑块占比计）；再切片后进行苏木精-伊红（HE）染
                                                              色，使用显微镜观察主动脉根部的形态学变化。
          个，待贴壁后，吸弃旧培养基，加入预先配制好的含药培
                                                              2.3.4 主动脉组织中CD86、CD206表达检测
          养基[由清热化痰活血方含药血清与培养基混合而成，
                                                                  采用免疫组化法检测。取“2.3.3”项下各组小鼠主
          质量浓度分别为0（对照组）、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL]，
                                                              动脉切片，脱蜡、抗原修复（高压煮沸 2 min）并封闭后，
          另设不含细胞、不含药物的调零组，将实验孔设为相应                            加入 CD86、CD206 荧光抗体（稀释比例均为 1∶500）于
          的处理组，每组设3个复孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中继                       4 ℃孵育过夜，次日加入二抗（稀释比例为1∶2 000）室温
          续培养24 h后，加入CCK-8工作液110 μL，作用2 h。使                   孵育1 h，用3，3′-二氨基联苯胺显色，苏木精复染，最后
          用酶标仪检测450 nm波长处各孔的光密度（optical den‐                  脱水透明、封片，使用显微镜观察并拍照，以棕黄色显色
          sity，OD），计算细胞活性：细胞活性（%）＝（加药组 OD                     区域为阳性信号，采用Image J软件分析其OD值。
                                                              2.3.5 主动脉组织中蛋白表达检测
          值－调零组 OD 值）/（对照组 OD 值－调零组 OD 值）×
                                                                  取“2.3.3”项下各组小鼠主动脉组织，液氮速冻研磨
          100%，并根据结果筛选3个对细胞活性具有显著促进效
                                                              后提取蛋白，BCA法定量后加热变性。取变性后的蛋白
          应且无细胞毒性的低、中、高浓度用于后续研究。
                                                              样品，经电泳分离并转至 PVDF 膜上，封闭后，分别与
          2.2.4 巨噬细胞凋亡检测
                                                              iNOS、Arg-1、AMPK、p-AMPK、PPAR-γ、GAPDH 抗体
              按“2.2.3”项下方法接种细胞并加药培养，含药培养                     （稀释比例分别为1∶1 000、1∶4 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶
          基包括0 μg/mL（对照组）和低、中、高浓度清热化痰活血                       1 000、1∶5 000）于4 ℃孵育过夜；次日加入相应二抗（稀
          方含药血清以及含阿托伐他汀（阳性对照，20 μg/mL）的                       释比例为1∶5 000），室温孵育2 h后，用ECL显影。采用
          培养基，每组设置3个复孔，分别作用24、48、72 h后，按                      Image  J 软 件 进 行 分 析 ，以 目 的 蛋 白 与 内 参 蛋 白

          Annexin Ⅴ/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，使用流式细                     （GAPDH）的灰度值比值评价目的蛋白的表达水平，再
                                                              以 p-AMPK 与 AMPK 的比值表示 AMPK 的磷酸化表达
          胞仪检测细胞凋亡率。
                                                              水平。
          2.2.5 巨噬细胞极化检测
                                                              2.4 统计学方法
              收 集“2.2.4”项 下 作 用 24  h 的 细 胞 ，使 用 CD86、
                                                                  采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料符合
          CD206荧光抗体进行表面染色，然后用流式细胞仪检测                          正态分布以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
          CD86（M1 型巨噬细胞）、CD206（M2 型巨噬细胞）的荧                    析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准
          光强度，以评价M1型和M2型巨噬细胞的极化情况。                            α＝0.05。


          · 440 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 4                               中国药房  2026年第37卷第4期
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