Page 54 - 《中国药房》2026年3期

后，收集细胞，用 PBS 洗涤 3 次，加入 Trizol 试剂提取细 2.9 统计学方法
胞中总 RNA；待检测其浓度、纯度后，将其逆转录为 采用SPSS 27.0和GraphPad Prism 10软件对数据进
cDNA；以此cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体 行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单
系包括：cDNA模板2 μL，10 μmol/L的正、反向引物（具 因素方差分析，进一步的组间两两比较采用LSD-t检验。
体序列及扩增产物长度见表 1）各 0.4 μL，SYBR Mix 试 检验水准α＝0.05。
剂 10 μL，焦碳酸二乙酯水 7.2 μL。PCR 反应条件为： 3 结果
94 ℃预变性 30 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s， 3.1 DXQ对细胞中总铁离子、GSH含量的影响
72 ℃延伸 45 s，共 40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 与si-NC组相比，si-GPX4组细胞中总铁离子含量显
2 －ΔΔCt 法计算GPX4、CypD mRNA的表达水平，结果以si- 著升高（P＜0.01），GSH 含量显著降低（P＜0.01）；与 si-
NC组为参照进行归一化处理。
GPX4 组相比，CsA 组、DXQ-H 组、DXQ-M 组细胞中总
表1 PCR引物序列及扩增产物长度 铁离子含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），GSH含量

目的基因 引物序列 产物长度/bp 均显著升高（P＜0.01）。结果见图1。
GPX4 正向：5′-GCCAAAGTCCTAGGAAACGC-3′ 20
150 10
反向：5′-CCGGGTTGAAAGGTTCAGGA-3′ ]
CypD 正向：5′-GGAGGTCCATCTACGGAAGC-3′ 20 8
反向：5′-ATGCTTGCCATCTAGCCAGTC-3′ （ μmol/L ） 100 a c （ 1×10 4 个细胞 ） b b
β-actin 正向：5′-GATATCGCTGCGCTGGTCG-3′ 19 b 6 b
反向：5′-CATTCCCACCATACCCT-3′ 总铁离子含量/ 50 b 4 a

2.8 细胞中铁死亡、MPTP相关蛋白表达检测 GSH含量/[μmol/ 2
采用免疫荧光法检测 GPX4、CypD 蛋白的表达情 0 0
况。取处于对数生长期的 BV2 细胞，按“2.3”项下方法 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
A.总铁离子 B. GSH
分组、处理。培养48 h后，吸弃培养基，细胞用PBS洗涤 Ⅰ：si-NC组；Ⅱ：si-GPX4组；Ⅲ：CsA组；Ⅳ：DXQ-H组；Ⅴ：DXQ-
1 次，再以 4% 多聚甲醛固定 20 min，加入免疫荧光封闭 M组；Ⅵ：DXQ-L组；a：与si-NC组相比，P＜0.01；b：与si-GPX4组相比，
P＜0.01；c：与si-GPX4组相比，P＜0.05。
液于室温下封闭10 min以减少非特异性结合；分别加入
图1 各组细胞中总铁离子、GSH含量比较（x±s，n＝3）
GPX4、CypD 一抗（稀释比例分别为 1∶500、1∶1 000），于
4 ℃下孵育过夜；加入相应荧光二抗（稀释比例均为 1∶ 3.2 DXQ 对细胞中 ROS 及线粒体中超氧化物表达的
500），于室温下避光孵育1 h；加入DAPI染液，于室温染 影响
核 5 min；以 PBS 洗涤细胞 3 次，加入抗荧光淬灭封片液 与 si-NC 组相比，si-GPX4 组细胞呈较强的绿、红色
适量后，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。使用 Im‐ 荧光，细胞中 ROS、超氧化物的表达水平均显著升高
age J 软件计算各组细胞中 GPX4、CypD 蛋白阳性表达 （P＜0.01）；与 si-GPX4 组 相 比 ，CsA 组 、DXQ-H 组 、
（分别呈红色、绿色）的平均光密度，用以表示各目的蛋 DXQ-M 组细胞绿、红色荧光明显减弱，细胞中 ROS、超
白的表达水平。 氧化物的表达水平均显著降低（P＜0.01）。结果见图 2
采用 Western blot 法检测铁死亡相关蛋白（GPX4、 （限于篇幅，荧光探针实验相关显微图可扫描本文首页
TfR1、FTH1）、MPTP 相 关 蛋 白（ANT、CytC、MCU、 二维码查看“增强出版”板块中的附图1）。
CypD）蛋白的表达情况。取处于对数生长期的 BV2 细 200 200 a
胞，按“2.3”项下方法分组、处理。培养 48 h 后，收集细 a 150
胞，提取细胞中总蛋白，经定量后进行变性处理。取变 150
性蛋白适量，经电泳分离后转膜，以封闭液于室温下封 ROS阳性表达的平均荧光强度 100 b 超氧化物阳性表达的平均荧光强度 100 b
闭20 min；洗膜后，加入GPX4、TfR1、FTH1、ANT、CytC、 50 50
CypD、MCU、β-actin 一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶ b b b b
0 0
1 000、1∶2 000、1∶1 500、1∶1 000、1∶1 000、1∶6 000、1∶
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
30 000），于 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀 A. ROS B.超氧化物
Ⅰ：si-NC组；Ⅱ：si-GPX4组；Ⅲ：CsA组；Ⅳ：DXQ-H组；Ⅴ：DXQ-
释比例均为 1∶3 000），于室温下孵育 2 h；以 TBST 洗膜
M组；Ⅵ：DXQ-L组；a：与si-NC组相比，P＜0.01；b：与si-GPX4组相比，
10 min×3 次，滴加 ECL 发光液曝光、成像。使用 Image P＜0.01。
J软件分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带的灰度 图2 各组细胞中 ROS、线粒体中超氧化物表达水平比
值比值表示各目的蛋白的表达水平。 较（x±s，n＝3）

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