Page 53 - 《中国药房》2026年3期
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桥生物技术有限公司；PCR引物、GXP4小干扰RNA（si-                     2.4 细胞中总铁离子、GSH含量检测
          GPX4）及其阴性对照（si-NC）（批号分别为 B541019、                      取处于对数生长期的 BV2 细胞，按“2.3”项下方法
          1943183592、1941893178）均由生工生物工程（上海）股                分组、处理。培养48 h后，收集细胞，按照相应试剂盒说
          份有限公司提供。                                           明书方法操作，使用酶标仪分别于550、405 nm波长处检
          1.3 实验动物和细胞                                        测各组细胞的总铁离子、GSH含量。
              8 周龄的 SPF 级雄性 SD 大鼠 20 只，体重 180～220            2.5 细胞中ROS及线粒体中超氧化物表达检测
          g，购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号为                               采用荧光探针法检测。（1）ROS检测：取处于对数生
          SCXK（辽）2023-0002。所有动物均常规饲养，实验方案                    长期的BV2细胞，按“2.3”项下方法分组、处理。培养48
          已通过辽宁中医药大学附属第二医院实验动物伦理委                            h 后，吸弃培养基，每孔加入 10 μmol/L 2′，7′-二氯二氢
          员会审核批准（编号：LZYY250401）。                             荧光素二乙酸酯试剂200 μL，于37 ℃下孵育20 min；吸
              小鼠小胶质细胞系BV2（货号CL-0493A）购自武汉                    弃上清液，细胞用不含血清的 DMEM 培养基洗涤 3 次，
          普诺赛生命科技有限公司。                                       加入抗荧光淬灭封片液适量后，置于倒置荧光显微镜下
          2 方法                                               观察并拍照。使用Image J软件计算各组细胞内ROS阳
                                                             性表达（呈绿色）的平均荧光强度，用以表示细胞内ROS
          2.1 DXQ的制备
                                                             的表达水平。（2）线粒体中超氧化物检测：取处于对数生
              选取大鼠20只，按体重随机分为空白组和癫痫清颗
                                                             长期的BV2细胞，按“2.3”项下方法分组、处理。培养48
                            [8]
          粒组。参照相关文献 ，癫痫清颗粒组大鼠灌胃相应药
                                                                                              TM
                                                             h 后，吸弃培养基，每孔加入 MitoSOX  Red 工作液 500
          液 20 g/kg（以生药量计；以水为溶剂，制成 2 g/mL 的药
                                                             μL，于37 ℃下孵育30 min；细胞用HBSS洗涤3次，加入
          液，灌胃体积为 10 mL/kg），空白组大鼠灌胃等体积水，
                                                             抗荧光淬灭封片液适量后，置于倒置荧光显微镜下观察
          每天1次，连续7 d。末次给药1 h后，大鼠以腹腔注射戊
                                                             并拍照。使用Image J软件计算各组细胞线粒体中超氧
          巴比妥钠（300 mg/kg）麻醉后，采集腹主动脉血；血样以
                                                             化物阳性表达区域（呈红色）的平均荧光强度，用以表示
          3 000 r/min 离心 15 min，得 DXQ 和正常血清，不灭活，
                                                             细胞线粒体内超氧化物的表达水平。
          于－80 ℃下保存，备用。
                                                             2.6 细胞线粒体膜电位及MPTP开放情况检测
          2.2 细胞培养及传代
                                                                （1）线粒体膜电位检测：取处于对数生长期的 BV2
              将BV2细胞接种于专用培养基中，于37 ℃、5%CO2
                                                             细胞，按“2.3”项下方法分组、处理。培养48 h后，吸弃培
          条件下培养。当细胞融合度达90%时进行传代操作，每
                                                             养基，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，每孔加入专
          48 h传代1次。
                                                             用培养基和JC-1染色工作液各500 μL，混匀，于37 ℃下
          2.3 分组、造模与给药
                                                             孵育20 min；吸弃上清液，细胞用JC-1染色缓冲液洗涤2
                                                5
              取处于对数生长期的BV2细胞，按2×10 个/mL、每
                                                             次，加入专用培养基2 mL后，置于倒置荧光显微镜下观
          孔 500 μL 接种于 6 孔板中，于 37 ℃、5%CO2条件下培
                                                             察并拍照。使用Image J软件计算各组细胞内JC-1聚合
          养，每 48 h 换液 1 次，待细胞融合度为 70%～80% 时，按
                                                             物（呈红色）及JC-1单体（呈绿色）的平均光密度，用以表
          照 Lipofectamine 3000 试剂说明书方法进行转染（经实
                                                             示细胞线粒体膜电位（红色荧光增强，表明线粒体膜电
          时荧光定量PCR法检测，若细胞中GPX4 mRNA的表达                       位升高；绿色荧光增强，表明线粒体膜电位降低）。（2）
          较正常细胞减少约 50%，表明 si-GPX4 转染成功 ）。将                   MPTP 开放情况检测：取处于对数生长期的 BV2 细胞，
                                                   [9]
          成 功 转 染 si-GPX4 的 细 胞 分 为 si-GPX4 组 、CsA 组 、       按“2.3”项下方法分组、处理。培养48 h后，吸弃培养基，
          DXQ-L 组、DXQ-M 组、DXQ-H 组，将成功转染 si-NC 的              细胞用PBS洗涤2次，加入黄绿素乙酰氧甲基酯染色液
          细 胞（经 实 时 荧 光 定 量 PCR 法 检 测 ，细 胞 中 GPX4            250 μL，混匀，于37 ℃下避光孵育30 min；吸弃染色液，
          mRNA 表达及形态、存活率较正常细胞无明显变化）作                         加入 37 ℃的专用培养基，再次于 37 ℃下避光孵育 30
          为si-NC组。每组设置3个复孔。其中，DXQ-L、DXQ-M、                   min；吸弃培养基，细胞用 PBS 洗涤 3 次，加入检测缓冲
          DXQ-H 组细胞分别加入含 5%、7%、10%DXQ 的专用培                   液后，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J
          养基（浓度参考前期CCK-8实验结果设置），其余各组细                        软件计算各组细胞内 MPTP 阳性表达（呈绿色）的平均
          胞均加入含10%正常血清的专用培养基；培养2 h后，除                        荧光强度，用以表示细胞内 MPTP 开放情况（两者成
          si-NC组细胞加入等体积专用培养基外，其余各组细胞均                        反比）。
          加入含 10 μmol/L Erastin 的专用培养基；培养 24 h 后，            2.7 细胞中GPX4、CypD mRNA表达检测
          CsA组细胞加入含1 μmol/L CsA的专用培养基，其余各                        采用实时荧光定量 PCR 法检测。取处于对数生长
          组细胞加入等体积专用培养基。                                     期的 BV2 细胞，按“2.3”项下方法分组、处理。培养 48 h


          中国药房  2026年第37卷第3期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 3    · 319 ·
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