Page 35 - 《中国药房》2026年2期
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表2 MM-PBSA计算所得SRC对接复合物的结合自由                          150            24 h      150             24 h
               能（x±s，kcal/mol）                                 100            48 h      100             48 h
          复合物          ΔE vdW  ΔE ele  ΔG GB  ΔG SA  ΔG bind  细胞存活率/%                  细胞存活率/%
          SRC-17β-雌二醇复合物  －30.0±3.6  －9.9±3.6  20.6±3.0  －3.7±0.4  －23.1±4.1  50        50
          SRC-槲皮素复合物  －35.0±4.3  －38.5±10.9  49.6±7.5  －5.5±0.2  －29.3±3.0
                                                                0                        0
          2.2 体外实验验证                                            10                    10                    10 1  10                    10                    10 1
                                                                 －1
                                                                         0
                                                                                          －1
                                                                                                  0
                                                                      西黄丸/（mg/mL）             西黄丸/（mg/mL）
          2.2.1 西黄丸溶液制备                                              A. SU-DHL2细胞             B.SU-DHL4细胞
              以 RPMI 1640 培养基将西黄丸配制成质量浓度为                    图5 不同浓度西黄丸对SU-DHL2和SU-DHL4细胞存
          0.1 g/mL 的混悬液，置于 4 ℃无菌密封容器中预冷 24 h                      活率的影响
          以促进成分释放。随后，使用超声波振动 2 h 以促进溶                        淀。使用 FITC 和 PI 染料进行染色，在室温下避光孵育
          解，并在4 ℃下继续孵育48 h。孵育结束后，将混合物以                       15 min，随后检测各组细胞的凋亡情况，并计算细胞凋亡
          0.22 μm 微孔滤膜过滤，收集滤液，即得西黄丸浸出                        率。细胞凋亡率（%）＝（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细
          液 。该浸出液分装后于－20 ℃下储存。实验前，使用                         胞数）/总细胞数×100%。
            [19]
          RPMI 1640 培养基将储存的西黄丸浸出液稀释至所需                           结果（表 3）显示，相较于对照组，西黄丸各浓度组
          工作浓度。                                              SU-DHL2、SU-DHL4细胞的凋亡率均升高，其中，中、高
          2.2.2  西 黄 丸 对 SU-DHL2 和 SU-DHL4 细 胞 增 殖 的         浓度组差异有统计学意义（P＜0.05），并有浓度依赖趋
          影响                                                 势，表明西黄丸能够显著诱导 SU-DHL2 和 SU-DHL4 细
              采用 CCK-8 法检测。将培养至对数生长期的 SU-                    胞凋亡。
          DHL2 和 SU-DHL4 细胞，分别接种于 96 孔板（每孔 1×                表3 各组 SU-DHL2 和 SU-DHL4 细胞的凋亡率比较
          10 个细胞）中，每孔 100 µL。参考相关文献 设置对照                          （x±s，n＝3，%%）
                                               [19]
            4
          组、空白组、西黄丸不同浓度组（10、5、2.5、1.25、0.625、                 组别               SU-DHL2细胞          SU-DHL4细胞
          0.312 5 mg/mL），每组设置 3 个复孔，分别作用 24、48 h              对照组               5.547±0.760        4.730±0.156
                                                              西黄丸低浓度组           7.150±0.651        6.890±0.042
          测得光密度（optical density，OD）。细胞存活率（%）＝                 西黄丸中浓度组          21.025±1.351 a     12.145±0.120 a
         （实验组OD－空白组OD）/（对照组OD－空白组OD）×                         西黄丸高浓度组          32.133±0.635 a     48.967±2.479 a
          100%。采用 GraphPad Prism 10.0 软件对数据进行统计                 a：与对照组相比，P＜0.05。
                                                             2.2.4 西黄丸对关键靶点 SRC 和 PI3K/Akt 信号通路相
          分析和绘图，将细胞存活率对药物浓度的对数进行拟
          合，计算半数抑制浓度（IC50 ）。满足正态分布的计量资                       关蛋白的影响
          料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两                            采用 Western blot 法检测。根据“2.2.3”项下方法选
          比较采用 LSD-t 检验；检验水准 α＝0.05（统计方法                     择 SU-DHL4 细胞进行分组与给药。给药处理 48 h 后，
          后同）。                                               收集细胞，使用预冷的磷酸盐缓冲液离心清洗细胞2次，
              结果（图5）显示，西黄丸在作用24、48 h时对两种细                    RIPA 裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓
          胞均表现出显著的细胞毒性效应，且呈现出浓度依赖性                           度，加热变性。取变性蛋白样品，经 10% 十二烷基磺酸
          趋势。在 48 h 时，细胞毒性更为明显，因此选择该时间                       钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行转膜，使用5%脱脂奶粉
          点计算 IC50。SU-DHL2 和 SU-DHL4 两种细胞的 48 h              封闭，加入相应一抗（SRC、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、
          IC50 分别为 2.06、2.83 mg/mL。基于此，后续实验 SU-              GAPDH稀释度均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；次日
          DHL2 细胞选择 1、2、4 mg/mL 为西黄丸低、中、高浓度                  加入二抗（稀释度为1∶5 000），室温下孵育2 h，用TBST
          组，SU-DHL4细胞选择1.4、2.8、5.6 mg/mL为西黄丸低、               缓冲液洗涤 3 次后，用 ECL 发光液进行显影，最后使用
          中、高浓度组。                                            Image  J 软 件 进 行 分 析 ，计 算 目 的 蛋 白 与 内 参 蛋 白
          2.2.3  西 黄 丸 对 SU-DHL2 和 SU-DHL4 细 胞 凋 亡 的        （GAPDH）灰度值比值以及磷酸化前后蛋白的灰度值
          影响                                                 比值。
              采用流式细胞术检测。将培养至对数生长期的SU-                            结果（图 6）显示，与对照组相比，西黄丸中、高浓度
                                         5
          DHL2和SU-DHL4细胞分别以1×10 个/mL接种于6孔                    组 SU-DHL4 细胞中 SRC 蛋白、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt
          板中，每孔加入2 mL培养液。设置对照组和西黄丸低、                         的表达均显著降低（P＜0.05），表明西黄丸可能通过
          中、高浓度组，每组设置3个复孔。给药处理48 h后，收                        SRC/PI3K/Akt 信号通路作用于 DLBCL，这与网络药理
          集细胞，使用磷酸盐缓冲液离心清洗细胞 2 次，收集沉                         学预测结果一致。


          中国药房  2026年第37卷第2期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 2    · 165 ·
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