Page 57 - 《中国药房》2026年1期
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         “2.3”项下）显著低于 Control 组，则表明造模成功 。本                   min。将切片转入磷酸盐缓冲液（PBS）中，于摇床上低
          研究共48只大鼠造模成功，失败2只。                                 速轻轻洗涤 3 次（每次 5 min）。吸干 PBS，滴加 3%H2O2
          2.2 动物分组与给药                                        溶液，在室温下避光孵育 20 min。PBS 洗涤 3 次（每次 5
              将造模成功的 48 只大鼠随机分为 LDH 组、QUE-L                  min），按照试剂盒说明书操作，添加 TUNEL 染液，在
          组、QUE-H组和QUE-H+EX-527组，每组12只。QUE-L                 37 ℃下孵育 1 h，加入 DAPI 染核。冲洗后，在显微镜下
                                                    [9]
          组、QUE-H组大鼠分别灌胃50、100 mg/kg的QUE 并腹                  观察切片（细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色），计算细胞
          腔注射等体积生理盐水；QUE-H+EX-527 组大鼠灌胃                      凋亡率。细胞凋亡率（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×
                                                      [10]
          100 mg/kg 的 QUE+腹腔注射 1 mg/kg 的 EX-527 溶液 ；         100%。
          LDH 组与 Control 组大鼠分别灌胃+腹腔注射等体积生                    2.7 大鼠椎间盘组织中MMP-3、PLA2表达检测
          理盐水；每天给药 1 次，连续 8 周。本研究应用的药物                           采用免疫组化染色法检测。取“2.5”项下椎间盘组
          QUE及EX-527，均采用ddH2O配制母液（超声20 min助                  织石蜡切片（每组随机取6个样本），脱蜡至水，灭活后封
          溶），并用生理盐水稀释至实验所需浓度。大鼠的灌胃                           闭，然后加入 MMP-3 和 PLA2 对应的一抗（稀释比例均
          体积为10 mL/kg。                                       为1∶200），4 ℃孵育过夜；次日，将一抗洗去并加入二抗
          2.3 大鼠疼痛阈值检测                                      （稀释比例为 1∶500），在 37 ℃下孵育 1 h；DAB 显色，苏
              末次给药结束，固定大鼠并使其保持安静，施力使                         木精复染，脱水透明封片。待封片结束后，将组织切片
          Von Frey 纤维丝垂直刺激大鼠后足表面，使纤维丝呈                       置于显微镜下观察并拍照（阳性区域呈棕黄色颗粒或块
         “S”形弯曲并持续 6～8 s，若大鼠出现撤足、舔爪、嚎叫                       状）。采用 Image J 软件计算 MMP-3 和 PLA2 对应的阳
          为阳性反应，将此时的最小刺激强度记为机械缩足反射                           性细胞数与总细胞数的百分比，以此表示 MMP-3 和
          阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。重     PLA2在椎间盘组织中的阳性表达率。
          复测定3次（每次测定间隔2 min），取平均值。                           2.8 大鼠椎间盘组织中 BAX、Bcl-2、FOXO3、Sirt1 蛋
              待 PWMT 测定结束，让大鼠休息 15 min 后，固定大                 白表达检测
          鼠并使其保持安静。将大鼠后足置于热痛仪上方的玻                                采用Western blot法检测。取“2.5”项下冻存的椎间
          璃板上，给予10～15 s热刺激，若大鼠出现缩足、足趾张                       盘组织（每组随机取 6 个样本），于液氮中研碎后，加
          开为阳性反应。记录大鼠从开始刺激到出现阳性反应                            入预冷的蛋白裂解液在冰上充分裂解，离心取上清液，
          的时间，即为热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal                    提取组织中总蛋白并定量。将蛋白煮沸变性，随后进行
          thermal latency，PWTL）。热刺激上限时间为 20 s，若超             10%SDS-PAGE 电泳（初始电压为 80 V，然后更换为 120
          过20 s按20 s计。重复测定3次（每次测定间隔5 min），                   V 电压继续电泳；电泳时间为 1 h），湿法转于 NC 膜上
          取平均值。                                             （恒流250 mA，转膜时间为1.5 h），用5%脱脂牛奶封闭。
          2.4 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10水平检测              添加对应一抗稀释液（BAX、Bcl-2、FOXO3、Sirt1的稀释
              采用ELISA法检测。疼痛阈值检测结束后，腹腔注                       比例均为 1∶1 000，β-actin 的稀释比例为 1∶2 000），于
          射过量戊巴比妥钠麻醉大鼠并于腹主动脉取血，低温离                           4 ℃下孵育过夜；次日，洗去一抗，添加对应二抗（稀释比
          心取上清液，按照相应 ELISA 试剂盒说明书操作，检测                       例为 1∶10 000），于 37 ℃下孵育 1 h。结束后，洗去条带
          血清中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10水平。                     上的二抗，添加ECL发光液，曝光后检测。采用Image J
          2.5 大鼠椎间盘组织病理损伤观察                                  软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带与内参（β-actin）
              采用 HE 染色法观察。取血结束后，颈部脱臼处死                       蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
          大鼠，取第4～5腰椎椎间盘组织。将部分椎间盘组织低                          2.9 统计学方法
          温冻存，备用。将另一部分椎间盘组织置于 4% 多聚甲                             采用SPSS 25.0软件分析数据。计量资料符合正态
          醛中固定，然后浸蜡包埋制备3 μm厚石蜡切片，二甲苯                         分布的用 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          脱蜡至水，行 HE 染色。清洗后，干燥封片，采用光学显                        组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
                                            [9]
          微镜观察染色图像并参考相关文献方法 对病理损伤进                           3 结果
          行评分，以评估椎间盘组织损伤程度（每组选6个样本进                          3.1 大鼠后足疼痛阈值检测结果
          行观察）。                                                  与 Control 组比较，LDH 组大鼠 PWMT、PWTL 均显
          2.6 大鼠椎间盘组织髓核细胞凋亡检测                                著 降 低/缩 短（P＜0.05）；与 LDH 组 比 较 ，QUE-L 组 、
              采用TUNEL染色法观察。取“2.5”项下椎间盘组织                     QUE-H 组大鼠 PWMT、PWTL 均显著升高/延长（P＜
          石蜡切片（每组随机取6个样本），经二甲苯脱蜡、梯度乙                         0.05），且QUE-H组大鼠上述指标显著高于/长于QUE-L
          醇脱水后，用去离子水浸泡洗涤，使组织完全被水浸润；                          组（P＜0.05）；与QUE-H组比较，QUE-H+EX-527组大鼠
          随后，滴加适量蛋白酶 K 工作液在 37 ℃下孵育 15～30                    PWMT、PWTL均显著降低/缩短（P＜0.05）。结果见表1。


          中国药房  2026年第37卷第1期                                                  China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1    · 51 ·
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