Page 44 - 《中国药房》2026年1期
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2947、3686），兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、                  2.4 细胞中ROS水平检测
          辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白 G                               采用 CM-H2DCFDA 荧光探针法检测。将 HL-60 细
         （IgG）二抗（美国 Affinity 公司，批号分别为 AF7021、                 胞按2×10 个/孔接种在6孔板中，按“2.2”项下方法分组
                                                                       6
          S0001）。                                            （每组设置 6 个复孔）、处理。培养结束后，根据 ROS 检
          1.3 细胞                                              测试剂盒说明书，以体积比 1∶1 000 的比例将无血清

              本研究所用的人急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60                        IMDM 培养基与 CM-H2DCFDA 探针均匀混合；去除每
          购自中国科学院上海生命科学研究院。                                   孔中培养基，加入稀释的 CM-H2DCFDA 探针，孵育 30
          2 方法                                                min；用无血清 IMDM 培养基充分洗去未进入细胞内的
          2.1 Esc浓度筛选                                         CM-H2DCFDA探针后，使用荧光显微镜观察，阳性细胞
              采用含 20% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素双抗的                     呈绿色荧光。通过Image J软件对荧光图像进行定量分
          IMDM完全培养基，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养                       析，获取各组细胞的荧光强度值，并计算相对荧光强度
          环境下培养HL-60细胞，每48～72 h更换一次新鲜培养                      （相对荧光强度＝实验组荧光强度值/Control 组荧光强
          基。待细胞传代培养至第3代后，选取处于对数生长期                            度值×100%）。实验重复3次。
          的细胞用于后续实验研究。使用含终浓度为 0（对照）、                          2.5 细胞凋亡检测
                                                                                                          6
          12、25、50、100、200 μmol/L（对应复孔数为6）的Esc培养                  采用流式细胞术检测。将 HL-60 细胞按 2×10 个/
                              [7]
          液处理HL-60细胞24 h 。采用MTT试剂盒检测不同浓                       孔接种在6孔板中，按“2.2”项下方法分组（每组设置6个
          度Esc对HL-60细胞存活率的影响，具体操作为：每孔中                        复孔）、处理。培养结束后，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 细
          加入10 µL MTT溶液，孵育4 h，再加入150 µL二甲基亚                   胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测，然后使用流式细胞
          砜终止反应；采用酶标仪在490 nm波长下检测各孔吸光                         仪对细胞的凋亡情况进行分析。实验重复3次。
          度（OD490 ），根据测量结果计算细胞存活率（细胞存活                        2.6 细胞中 AKT/SKP2/MTH1 通路和 AKT 上下游效
          率＝实验组 OD490值/对照组 OD490值×100%），并采用非                  应蛋白表达检测
          线性回归法计算药物对细胞增殖的半数抑制浓度（half                              采用 Western blot 法检测。将 HL-60 细胞按 2×10       6
          maximal inhibitory concentration，IC50 ）。实验重复3次。     个/孔接种在 6 孔板中，按“2.2”项下方法分组、处理。培
          2.2 细胞分组                                            养结束后，收集细胞，经 RIPA 裂解液充分裂解后，离心
              将 HL-60 细胞分为对照组（Control 组）、Esc 低浓度              收集上清，获得总蛋白提取物。采用 BCA 法测定总蛋
          组（L-Esc 组）、Esc 中浓度组（M-Esc 组）、Esc 高浓度组               白浓度，并于蛋白变性后，进行 SDS-PAGE 电泳、转膜、
         （H-Esc 组）、Esc 高浓度+SC79 组。其中，Control 组细胞              封闭；结束后，在4 ℃摇床上将膜与一抗Bcl-2（稀释比例
          常规培养 24 h，L-Esc 组、M-Esc 组、H-Esc 组细胞分别使              为1∶2 000）、Bax（稀释比例为1∶1000）、cleaved caspase-3
          用含25、50、100 μmol/L Esc的培养液处理24 h，Esc高浓             （稀释比例为1∶100）、p-AKT（稀释比例为1∶1 000）、AKT
          度+SC79组细胞使用含100 μmol/L Esc及5 μmol/L SC79           （稀释比例为1∶1 000）、SKP2（稀释比例为1∶1 000）、MTH1
                          [9]
          的培养液处理24 h 。                                       （稀释比例为 1∶1 000）、p-PI3K（稀释比例为 1∶1 000）、
          2.3 细胞增殖能力检测                                        PI3K（稀释比例为1∶1 000）、P21（稀释比例为1∶1 000）、
             （1）MTT实验：将生长状态良好的HL-60细胞按1×                      P27（稀释比例为1∶1 000）、GAPDH（稀释比例为1∶8 000）
            5
          10 个/孔接种在 96 孔板中，按“2.2”项下方法分组（每组                    孵育过夜，再在37 ℃下将膜与二抗（稀释比例为1∶5 000）
          设置 6 个复孔）、处理，按“2.1”项下 MTT 法检测细胞存                    孵育 1 h；在凝胶成像系统中曝光 ECL 发光液孵育后的

          活率。实验重复3次。                                          蛋白条带，并拍照。采用 Image J 软件统计蛋白条带灰
             （2）克隆形成实验：将生长状态良好的 HL-60 细胞                      度值，以目标蛋白与内参（GAPDH）蛋白条带灰度值的
                 3
          按 1×10 个/孔接种在 6 孔板中，按“2.2”项下方法分组                    比值表示目标蛋白的表达水平，以磷酸化蛋白与总蛋白
         （每组设置 6 个复孔）、处理。在 37 ℃、5%CO2培养箱中                     条带灰度值的比值表示相应蛋白的磷酸化水平。实验
          培养至肉眼可见的细胞集落后（显微镜下观察可见大的                            重复3次。
          细胞团块，单个细胞集落中细胞数＞50 个），停止培养。                         2.7 统计学方法
          以4%多聚甲醛固定细胞后进行结晶紫染色、拍照，统计                               采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析。符合正态
          细胞的集落数。实验重复3次。                                      分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方


          · 38 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1                                中国药房  2026年第37卷第1期
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