Page 38 - 《中国药房》2026年1期
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KM小鼠，体重（20±2）g，购自山东朋悦实验动物繁殖有                        2.2.4 小鼠脑皮质区 CD206/Iba1 和 iNOS/Iba1 共定位
          限公司，动物生产许可证号为 SCXK（鲁）20220006。本                     观察
          研究通过河南中医药大学实验动物福利伦理委员会批                                 采用免疫荧光双染法观察。取“2.2.3”项下剩余部
          准（伦理号为 DWLL202103162）。小鼠适用性饲养 1 周                   分切片，经脱蜡、水化处理后进行抗原热修复处理；待切
          后开始实验，自由饮水和摄食，实验环境温度为 22～                           片冷却后，用封闭液封闭 90 min，再分别加入 CD206
          24 ℃、相对湿度为40%～60%。                                 （稀释度为1∶500）与Iba1（兔抗，稀释度为1∶200）抗体混
          2 方法                                                合液、iNOS（稀释度为 1∶800）与 Iba1（鼠抗，稀释度为
          2.1 细胞实验                                            1∶1 000）抗体混合液，于4 ℃条件下孵育过夜。次日，以
          2.1.1 细胞培养                                          磷酸盐缓冲液清洗后，加入相应二抗（稀释度为1∶500），
              将BV2细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素                        避光孵育90 min，以DAPI封片剂封片后，采用荧光显微
          的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每隔                      镜观察小鼠脑皮质区CD206/Iba1和iNOS/Iba1的共定位
          1 d更换1次培养基。当细胞融合度达80%时进行传代。                         情况。每张切片随机选取3个视野，通过Image J软件定
          2.1.2 细胞上清液中IL-6、TNF-α、NO水平检测                       量分析共定位阳性细胞数；iNOS/Iba1 共定位阳性细胞
                                4
              将 BV2 细胞以 1×10 个/孔的密度接种于 96 孔板，                 数越多表示小胶质细胞发生 M1 型极化，CD206/Iba1 共
          待细胞贴壁后进行换液处理，然后分为对照组、LPS 组                          定位阳性细胞数越多表示小胶质细胞发生M2型极化。
          和黄芪甲苷20、40 μmol/L组以及DEX组（2 μmol/L），各                2.2.5 小鼠脑组织中 NF-κB/MAPK 信号通路相关蛋白
                                                 [9]
          给药组浓度参考本课题组前期研究结果设置 ，每组设                            表达检测
          置6个复孔；饥饿处理4 h后，各给药组加入相应浓度药                              采用 Western blot 法检测。取各组小鼠脑组织适
          液，对照组、LPS组加入等体积培养基；干预1 h后，除对                        量，经RIPA裂解液裂解后离心收集上清液，采用BCA法
          照组外其余各组均加入质量浓度为 1 μg/mL 的 LPS 溶                     定量蛋白浓度。蛋白经变性处理后，进行十二烷基硫酸
          液，继续培养 24 h 后收集上清液；根据相应试剂盒说明                        钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭后，加入 p38
          书方法操作，检测各组细胞上清液中炎症因子 IL-6、                          MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK、NF-κB p65、p-NF-
          TNF-α、NO水平。                                         κB p65、GAPDH 一抗（稀释度分别为 1∶1 500、1∶800、
          2.2 动物实验                                            1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），于 4 ℃下
          2.2.1 分组、给药、造模与取材                                   孵育过夜。次日，加入相应二抗（稀释度为1∶3 000），于
              将 30 只小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组                       室温下孵育1 h，以ECL化学发光试剂显影，凝胶成像系
         （阿司匹林肠溶片，20 mg/kg，剂量约为成人临床等效剂                        统成像，采用 Image J 软件分析蛋白灰度值。以目标蛋
          量的 8 倍）和黄芪甲苷低、高剂量组 （10、20 mg/kg，剂                   白与内参（GAPDH）的灰度值比值表示目标蛋白的表达
                                         [10]
          量根据文献[12]设置），每组 6 只。根据文献报道方法                  [11]  水平；以p-p38 MAPK与p38 MAPK、p-NF-κB p65与NF-
          进行造模，黄芪甲苷各剂量组小鼠腹腔注射相应药物，                            κB p65、p-ERK与ERK表达水平的比值，表示p38 MAPK、
          阳性对照组小鼠灌胃相应药物，正常组、模型组小鼠灌                            NF-κB p65、ERK蛋白的磷酸化水平。
          胃并注射等体积生理盐水，每天1次，连续14 d。除正常                         2.2.6 统计学方法
          组外，其余各组小鼠每天给药/生理盐水1 h后，腹腔注射                             采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量数据满足
          LPS（250 μg/kg）以建立神经炎症模型。末次注射LPS 2                   正态分布，以 x±s 表示。若方差齐，多组间比较采用单
          h后，小鼠经眼眦取血适量，置于－80 ℃冰箱保存备用。                         因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；若方差
          另外，各组处死3只小鼠，剖取脑组织，取一半脑组织用                           不齐，采用Tamhane’s T2法进行分析。检验水准α＝0.05。
          4% 多聚甲醛溶液固定，用于病理学形态观察和免疫荧                           3 结果
          光染色观察，其余脑组织置于－80 ℃冰箱保存，用于相                          3.1 黄芪甲苷对 BV2 细胞上清液中 IL-6、TNF-α、NO
          关蛋白表达检测。                                            水平的影响
          2.2.2 小鼠血清中IL-6、TNF-α水平检测                               与对照组比较，LPS 组细胞上清液中 IL-6、TNF-α、
              取“2.2.1”项下血样，离心处理后取血清适量，根据                      NO 水平均显著升高（P＜0.05）；与 LPS 组比较，各给药
          ELISA 试剂盒说明书方法操作，检测小鼠血清中 IL-6、                      组细胞上清液中IL-6、TNF-α、NO水平均显著降低（P＜
          TNF-α水平。                                            0.05）；与DEX组比较，黄芪甲苷各浓度组细胞上清液中
          2.2.3 小鼠脑组织病理学形态观察                                  IL-6、TNF-α、NO（黄芪甲苷 40 μmol/L 组 NO 除外）水平
              取“2.2.1”项下于4%多聚甲醛溶液中固定的脑组织                      均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
          适量，经乙醇梯度脱水后进行石蜡包埋、切片；取部分切                           3.2 黄芪甲苷对模型小鼠血清中 IL-6、TNF-α 水平的
          片用二甲苯脱蜡至水，再进行苏木素-伊红（HE）染色，经                         影响
          梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，以中性树胶封片；采用显                               与正常组比较，模型组小鼠血清中 IL-6、TNF-α 水
          微镜观察小鼠脑组织病理学形态，并拍照。                                 平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠


          · 32 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1                                中国药房  2026年第37卷第1期
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