Page 58 - 《中国药房》2025年22期
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h暗交替；小鼠自由进食和饮水，隔天更换垫料。本研究                           2.1.6 小鼠主动脉中巨噬细胞极化标志物表达检测
          动物实验方案已获得河北工程大学附属医院动物伦理                                 采用免疫荧光法检测。将“2.1.5”项下处理完毕的
          委员会批准（伦理审查批号：IACUC-Hebeu-2025-0007）。                主动脉石蜡切片（每组随机抽取3只小鼠样本）脱蜡并进
          1.4 细胞                                              行抗原修复，使用PBS冲洗完毕后滴加稀释好的正常山
              小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）购自武                      羊血清，室温封闭 30 min，以减少非特异性染色。滴加
          汉梓杉生物技术有限公司。                                        CD86和CD206一抗（稀释比例均为1∶500），于4 ℃冰箱
          2 方法                                                中孵育过夜；PBS洗涤后加入荧光二抗（稀释比例为  1∶
          2.1 动物实验                                            2 000），室温孵育50 min。使用DAPI染液进行细胞核避
          2.1.1 分组、造模与给药                                      光孵育5 min，滴加抗荧光淬灭剂后封片，置于荧光显微
              将 8 只 C57BL/6J 小鼠作为对照组（CON 组），给予                镜下观察并拍照。采用Image J软件对荧光强度进行定
          普通饲料喂养，自由饮水。将32只APOE               －/－ 小鼠以随机        量分析：绿色荧光对应 M1 型巨噬细胞表面标志物
                                                                  +
          数字表法分为模型组（MOD组）、ALO低剂量组（ALO-L                       CD86 ，红 色 荧 光 对 应 M2 型 巨 噬 细 胞 表 面 标 志 物
                                                                   +
                                                              CD206 ；荧光强度越高，表示对应表型（M1或M2型）的
          组）、ALO高剂量组（ALO-H组）和阿托伐他汀阳性对照
                                                              巨噬细胞的极化程度越高。
          组（ATO组），每组8只，给予高脂饲料（配方：40%脂肪，
                                                              2.1.7 小鼠主动脉中巨噬细胞极化相关基因表达检测
          1.25% 胆固醇，0.5% 胆酸）喂养。喂养 12 周后，ALO-L
                                                                  采用 RT-qPCR 法检测。每组随机抽取 3 只小鼠主
          组、ALO-H组、ATO组小鼠分别按20、40、4 mg/（kg·d）灌
                                                              动脉样本，剪取适量组织，按照RNA提取试剂盒说明书
          胃相应药物     [9―10] ，CON 组和 MOD 组小鼠灌胃等体积去
                                                              操 作 提 取 并 检 测 RNA 的 浓 度 及 纯 度 ，逆 转 录 合 成
          离子水；每 2 周测定体重 1 次，根据体重变化调整灌胃
                                                              cDNA，以 cDNA 为模板进行 RT-qPCR 反应。PCR 反应
          量，持续给药8周。在实验结束前最后一次测定小鼠体
                                                              体系为：2´SYBR Green Premix（10 μL），正、反向引物各
          重（即末周体重），分析ALO对小鼠体重的影响。
                                                              0.4 μL，cDNA模板2 μL，无核酸酶水7.2 μL。反应程序
          2.1.2 标本采集
                                                              为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s，65 ℃退火 10 s，
              实验结束后小鼠禁食不禁水12 h，使用异氟烷麻醉
                                                              72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶
          小鼠，摘除眼球取血后使用颈椎脱臼法将其处死。将采
                                                             （GAPDH）为内参，采用2        －ΔΔCT 法计算目的基因mRNA的
          集到的血液于室温下静置2 h，在4 ℃下以3 500 r/min离
                                                              相对表达水平。引物序列及扩增产物大小见表1。
          心15 min，将上层血清转移至新的1.5 mL离心管中。解
                                                                        表1 引物序列及扩增产物大小
          剖小鼠，剥离主动脉，留取标本用于后续实验。
                                                              基因名称        序列（5′→3′）                  产物大小/bp
          2.1.3 小鼠血脂水平测定                                      iNOS        正向：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA   127
              将各组小鼠的血清样本解冻后，按照相应试剂盒说                                      反向：GTGGACGGGTCGATGTCAC
          明书操作，使用酶标仪检测小鼠血清中TG、TC、LDL-C、                       TNF-α       正向：ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC    179
                                                                          反向：GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA
          HDL-C水平。                                            Arg-1       正向：CATATCTGCCAAAGACATCGTG    196
          2.1.4 小鼠主动脉斑块面积检测                                               反向：GACATCAAAGCTCAGGTGAATC
              采用油红O染色法检测。每组随机抽取3根小鼠主                          IL-10       正向：GCTCTTACTGACTGGCATGAG     105
                                                                          反向：CGCAGCTCTAGGAGCATGTG
          动脉进行油红 O 染色。将完整的小鼠主动脉剥离后置
                                                              GAPDH       正向：CAAAGTGGAGATTGTTGCCAT      96
          于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h，去除血管表面脂肪后                                   反向：CCGTTGAATTTGCCGTGA
          纵向剖开血管，然后将主动脉浸入 60% 异丙醇中 3～5                        2.1.8 小鼠主动脉组织中 iNOS、Arg-1 与 NF-κB/STAT3
          s，接着再浸入油红 O 染色液中，在 37 ℃下染色 1 h。取                    信号通路相关蛋白表达检测
          出血管，使用 60% 异丙醇分化去除血管外背景色，将染                             采用 Western blot 法检测。每组随机抽取 3 只小鼠
          好的血管铺开，置于黑色背景板上拍照。使用 Image J                        主动脉样本，剪取部分组织，加入适量RIPA裂解液低温
          软件对斑块面积进行定量分析。主动脉组织上红色部                             研磨并提取蛋白，使用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白
          分为脂质沉积，颜色越深、范围越广表示脂质沉积越多、                           浓度。取20 μg变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙
          AS病变程度越高。                                           烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压120 V，分离胶电压90 V），
          2.1.5 小鼠主动脉病理学形态观察                                  并在恒流 300 mA 下转膜 90 min 至聚偏二氟乙烯膜，使
              采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。剥离出小鼠主                        用 5% 脱脂奶粉或 5% 牛血清白蛋白室温摇床封闭 2 h；
          动脉弓部分，剔除血管表面脂肪后置于 4% 多聚甲醛溶                          使用 TBST 洗膜 3 次、每次 10 min，加入 iNOS、Arg-1、
          液中固定24 h。取出血管并使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲                        p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-STAT3、STAT3一抗（稀释比
          洗，使用滤纸吸干表面水分后依次进行脱水、包埋、切片                           例均为1∶1 000）和β-actin（稀释比例为1∶5 000），4 ℃下
         （厚4 μm）。脱蜡后进行HE染色并在显微镜下拍照。                           孵育过夜；次日回收一抗后使用TBST洗膜3次、每次10


          · 2804 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 22                            中国药房  2025年第36卷第22期
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