Page 51 - 《中国药房》2025年20期
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过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）                       2.3 大鼠一般状况观察
          二抗（H&L）（批号分别为ab264475、ab305029、ab76252、                实验期间，观察各组大鼠的皮毛状况、精神状态、饮
          ab52771、ab307440、ab8226、ab205719）均 购 自 英 国         食及活动情况。
          Abcam 公 司 ；HRP 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（批 号           2.4 大鼠右心功能指标检测
          GB23303）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Masson                         末次给药后，将各组大鼠麻醉，置于加热垫上，维持
          染液（批号JK-182）购自上海经科化学科技有限公司；苏                       其体温为37 ℃，以多普勒超声诊断仪检测其右室内径、
          木精-伊红（HE）染液（批号G1120）购自北京索宝莱科技                      右房内径、舒张末期容积。连续收集3个心动周期的数
          有限公司；RIPA裂解缓冲液（批号P0013）购自上海碧云                      据，结果取平均值。
          天生物技术股份有限公司。                                       2.5 大鼠右心-肺循环血流动力学指标检测
          1.3 实验动物                                               心脏超声检查结束后，继续以多普勒超声诊断仪检
              SPF 级雄性 SD 大鼠（7 周龄，体重 250～280 g）购自             测各组大鼠的肺动脉血流加速时间（pulmonary artery
          哈尔滨医科大学实验动物学部，动物生产许可证号为                            blood  flow  acceleration  time，PAAT）及 其 与 射 血 时 间
          SCXK（黑）2024-002。所有大鼠均在温度 20～25 ℃、相                （ejection time，ET）的比值（PAAT/ET）、肺动脉压及其与
          对湿度50%～60%、每12 h光照/黑暗循环的动物房内饲                      肺动脉血流速度的比值（肺动脉压/速度）。连续收集 3
          养，自由摄食、饮水。所有实验程序均遵循动物护理和                           个心动周期的数据，结果取平均值。
          使用的相关指南，并通过牡丹江医科大学附属红旗医院                           2.6 大鼠血浆脑钠肽、AngⅡ水平检测
          伦理委员会批准（伦理编号20240129）。                                 肺动脉超声检查结束后，采集各组大鼠尾静脉血，
          2 方法                                               将血样置于含乙二胺四乙酸的抗凝管中，于 4 ℃下以
          2.1 药液制备                                           1 200×g离心15 min，分离上层血浆，按照相应试剂盒说
              取炙鳖甲、川芎、白术、附子、白芍、脐带、鹿角片饮                       明书方法操作，以酶标仪检测其脑钠肽、AngⅡ水平。
          片各10 g，补骨脂、淫羊藿、茯苓、猪苓饮片各15 g，混合，                    2.7 大鼠心脏组织病理学变化观察
          加8倍量水浸泡30 min，以武火煮沸后转文火煎煮1.5 h，                    2.7.1 HE染色
          过滤；药渣再加6倍量水，煎煮1 h，过滤；合并两次滤液，                           采血后，将各组大鼠处死，迅速打开胸腔，剖取心
          减压浓缩，制得温阳利水方浸膏（每1 mL浸膏约含生药                         脏，分离右心室，剥离脂肪及结缔组织后，取部分冻存，
          量3 g）。                                             备用；取另一部分经4%甲醛溶液固定后，行常规石蜡包
          2.2 造模、分组与给药                                       埋、切片（厚度5 μm）。取上述切片，经脱蜡、复水、苏木
              所有大鼠均适应性喂养1周。随机选取10只大鼠，                        精染色（3 min）、分化、伊红染色（5 s）、脱水、封片后，使
          作为对照组。其余 63 只大鼠按下法构建肺动脉高压致                         用显微镜观察其心脏组织病理改变。
          RHF 模型 ：大鼠单次腹膜内注射野百合碱（60 mg/kg，                    2.7.2 Masson染色
                  [8]
          以无水乙醇为溶剂）诱导肺动脉高压；6 周后，大鼠经多                             取“2.7.1”项下各组大鼠的右心室组织切片，经脱
          普勒超声诊断仪检查，若出现心功能不全（右室内径、右                          蜡、复水、Masson 染色、风干、透明、封片后，使用显微镜
          房内径、舒张末期容积明显升高），则表明肺动脉高压致                          观察其心脏组织纤维化改变（其中，红细胞、纤维素、肌
          RHF模型构建成功。在此过程中，有8只大鼠死亡、5只                         纤维呈红色，胶原纤维、软骨呈蓝色），并采用Image J软
          不符合造模标准。将造模成功的 50 只大鼠随机分为                          件计算胶原容积分数，即染色阳性面积（蓝色）占总面积
          RHF组、温阳利水方低剂量组（温阳利水方-低组）、温阳                        的百分比。
          利水方高剂量组（温阳利水方-高组）、呋塞米组和温阳                          2.8 大鼠心脏组织中Hippo/YAP信号通路相关蛋白表
          利水方高剂量+Hippo/YAP 信号通路激活剂组（温阳利                      达检测
          水方-高+PY-60 组），每组 10 只。参考预实验及相关文                        采用 Western blot 法检测。取“2.7.1”项下各组大鼠
            [9]
          献 ，温阳利水方-低、高组大鼠分别灌胃4.25、17.00 g/kg                 冻存的心脏组织，加入裂解缓冲液提取其总蛋白，以
          的温阳利水方（以生药量计，以水为溶剂）并同时尾静脉                          BCA法检测蛋白浓度后作变性处理。取变性蛋白，进行
          注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周；参考预实验及                         8%～12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，
                 [10]
          相关文献 ，呋塞米组大鼠灌胃20 mg/kg的呋塞米（以二                      然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，以脱脂牛奶封闭；洗膜
          甲基亚砜为溶剂）并同时尾静脉注射等体积生理盐水，每                          后，加入 p-LATS1/2、LATS1/2、p-YAP、YAP、TAZ、β-actin
                                              [11]
          天 1 次，连续 4 周；参考预实验及相关文献 ，温阳利水                     （稀释度均为 1∶500）一抗，于 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，
          方-高+PY-60 组大鼠灌胃 17.00 g/kg 的温阳利水方并同                加入相应二抗（稀释度均为 1∶1 000），于室温下孵育 60
          时尾静脉注射 16 mg/kg 的 PY-60（以二甲基亚砜为溶                   min；洗膜后，以增强化学发光溶液曝光、显影、成像。使
          剂），每天1次，连续4周；对照组和RHF组大鼠灌胃并同                        用Image J软件，以各目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰
          时尾静脉注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。                           度值比值表示各目的蛋白的表达水平，以 p-LATS1/2 与


          中国药房  2025年第36卷第20期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 20    · 2533 ·
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