Page 49 - 《中国药房》2025年19期
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1.3 动物与细胞                                          2.4 细胞造模、分组与给药
              本研究所用动物为 8 周龄 SPF 级 Wistar 雄性大鼠，                   取对数生长期的BV-2细胞适量，加入1 μg/mL LPS
          共 40 只，体重（250±20）g，均购于北京维通利华实验动                    刺激细胞 12 h，换液后继续培养 12 h，取上清液刺激
          物有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（京）2021-                       HT22细胞以复制损伤模型；另制备未经LPS刺激的BV-
          0011。大鼠饲养于山西中医药大学实验管理中心 SPF                        2细胞上清液。取对数生长期的HT22细胞分为KB-Exo
          级动物房，自由饮水与进食，环境温度（22±3）℃、相对                        组（未经LPS刺激的上清液+KB-Exo）、模型组（即model
          湿度 40%～50%、自然昼夜节律。本研究涉及的所有动                        组，经 LPS 刺激的上清液+KB-Exo）、PLXT-Exo 组（经
          物实验均符合动物伦理学操作要求，且经山西中医药大                           LPS 刺激的上清液+PLXT-Exo）和 NZN-Exo 组（经 LPS
          学实验动物伦理委员会批准（伦理批号为2021DW031）。                      刺激的上清液+NZN-Exo），各组相应Exo的浓度均为50
              小鼠小胶质细胞 BV-2（货号 TCM-C718）购自苏州                  μg/mL（浓度根据预实验结果设置）。
          海星生物科技有限公司；小鼠海马神经元细胞HT22（货                         2.5 HT22细胞增殖能力检测
          号FH1027）购自上海富衡生物科技有限公司。                            2.5.1 CCK-8法检测
                                                                                             4
          2 方法                                                   将HT22细胞（细胞密度为4×10 个/mL，下同）接种
          2.1 脑震宁药液的制备                                       于 96 孔板，按“2.4”项下方法造模、分组与给药（经/未经
                                                             LPS刺激的上清液加入量为100 μL，下同），并设置调零
              根据处方比例称取生地黄、牡丹皮、当归、丹参、川
                                                             孔（只含培养基不含细胞），然后置于培养箱中培养 24
          芎、炒酸枣仁、柏子仁、陈皮、竹茹、茯苓、地龙饮片适量，
                                                             h；加入 CCK-8 溶液处理 4 h，采用酶标仪于 450 nm 波长
          加入10倍量水浸泡30 min后大火烧开，之后转小火煎煮
                                                             下测定光密度值，并计算细胞增殖率，细胞增殖率
          40 min，过滤；药渣再次加入 8 倍量水，用大火煮沸后转
                                                            （%）＝（实验组光密度值－调零孔光密度值）/（KB-Exo
          小火煎煮40 min，过滤；将两次煎出的药液混合，水浴加
                                                             组光密度值－调零孔光密度值）×100%。以上每组样
          热浓缩成质量浓度为 6.68 g/mL 的脑震宁药液（以生药
                                                             本数为6。
          量计）。
                                                             2.5.2 EdU法检测
          2.2 Exo的制备
                                                                 将HT22细胞接种于6孔板，按“2.4”项下方法造模、
              将Wistar大鼠随机分为空白组（生理盐水，n＝20）、
                                                             分组与给药，培养24 h后收集细胞，加入500 μL EdU工
          吡拉西坦组（阳性对照，1.62 g/kg，n＝10）、脑震宁组
                                                             作液孵育1～2 h，去除工作液；加入固定液孵育20 min，
         （66.83 g/kg，n＝10），其中脑震宁组和吡拉西坦组大鼠灌
                                                             洗涤细胞3次，加入通透液孵育10 min，再次洗涤细胞3
          胃相应药液，剂量均参考文献[8]设置，空白组大鼠灌胃
                                                             次；加入500 μL Click反应液（现用现配），室温避光孵育
          等体积生理盐水。所有大鼠每天灌胃2次，连续7 d。末
                                                             30 min，洗涤细胞 3 次；加入 Hoechst 33342 染色液室温
          次给药后1 h，各组大鼠腹主动脉取血，血样以3 500 r/min
                                                             避光孵育10 min，洗涤细胞3次，置于荧光显微镜下观察
                                 [9]
          离心20 min，收集上层血清 ，然后采用超速离心法分离
                                                             各组细胞染色情况（EdU阳性细胞为绿色），计算细胞增
          提取 Exo，即得外周血来源 Exo。按以上步骤得到空白
                                                             殖率，细胞增殖率（%）＝EdU 阳性细胞数/细胞总数×
          组Exo（即KB-Exo）、吡拉西坦组Exo（即PLXT-Exo）、脑
                                                             100%。以上每组样本数为6。
          震宁组Exo（即NZN-Exo），采用BCA法对其进行蛋白浓
                                                             2.6 HT22细胞凋亡情况检测
          度测定，再进行后续实验。                                           采用 TUNEL 法检测。将 HT22 细胞接种于 6 孔板，
          2.3 Exo的鉴定                                         按“2.4”项下方法造模、分组与给药，培养 24 h 后收集细
              取“2.2”项下KB-Exo、PLXT-Exo、NZN-Exo适量，滴            胞，以4%多聚甲醛室温固定30 min，再用0.3%Triton X-
          加在铜网上沉淀1 min，然后用滤纸吸去浮液；加醋酸双                        100 溶液室温孵育 10 min；加入 TUNEL 工作液适量，置
          氧铀继续沉淀 1 min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，                       于培养箱中孵育60 min，然后加入DAPI溶液（1 μg/mL）
          然后采用透射电子显微镜观察各Exo形态并采集图像。                          避光标记细胞核约10 min；采用荧光显微镜观察细胞凋
          取 KB-Exo、PLXT-Exo、NZN-Exo 适量，采用纳米流式检               亡情况，并拍照。每组随机选取 6 个视野，对凋亡细胞
          测仪测量Exo粒径（每种样品平行测定3次，取平均值）。                       （呈绿色）和正常细胞（呈蓝色）分别进行计数，并计算细
          另外，取上述3组Exo适量，以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释                       胞凋亡率，细胞凋亡率（%）＝凋亡细胞数/（凋亡细胞数+
          后，加入荧光标记的抗体 CD9 和 CD81，37 ℃避光孵育                    正常细胞数）×100%。以上每组样本数为6。
          30 min；加入预冷的 PBS，以 30 000 r/min 超速离心 70            2.7 HT22细胞超微结构观察
          min，取上清液再次以同样的条件超速离心；去除上清液                             采用铀-铅染色法观察。将 HT22 细胞接种于 6 孔
          后用PBS重悬，使用纳米流式检测仪检测各Exo表面抗                         板，按“2.4”项下方法造模、分组与给药，培养24 h后收集
          体CD9和CD81的阳性率。                                     细胞，于 4 ℃条件下以 1 500 r/min 离心 10 min，加入


          中国药房  2025年第36卷第19期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 19    · 2395 ·
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