Page 44 - 《中国药房》2025年18期

OD值－空白组OD值）×100%。 表1 引物序列及产物大小
2.3 EGCG联合仑伐替尼对细胞克隆形成能力的影响 目的基因 引物 引物序列（5′→3′） 产物大小/bp
采用克隆形成实验检测。取对数生长期的 5 种细 PI3K 正向 TATTTGGACTTTGCGACAAGACT 190
反向 TCGAACGTACTGGTCTGGATAG
胞，按1×10 个/孔接种至6孔板中，分为对照组、仑伐替 Akt 正向 AGCGACGTGGCTATTGTGAAG 96
3
尼组（10 μmol/L）和不同质量浓度 EGCG+仑伐替尼组 反向 GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT
（1、5、10 μg/mL EGCG+10 μmol/L仑伐替尼），每组设置 mTOR 正向 ATGCTTGGAACCGGACCTG 173
反向 TCTTGACTCATCTCTCGGAGTT
3个复孔。培养至细胞贴壁24 h后，更换培养基；继续培
P70S6K 正向 CGGGACGGCTTTTACCCAG 195
养 2 周后，弃去上清液，细胞以结晶紫染色 30 min，再用 反向 TTTCTCACAATGTTCCATGCCA
磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，待干燥后，使用显微镜观 4EBP 正向 CTATGACCGGAAATTCCTGATGG 161
反向 CCCGCTTATCTTCTGGGCTA
察各组细胞的克隆形成情况，采用 Image J 软件统计克
PTEN 正向 TGGATTCGACTTAGACTTGACCT 231
隆形成数（将大于50个细胞的集落记为1个克隆）。 反向 GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG
2.4 EGCG联合仑伐替尼对细胞增殖率的影响 GAPDH 正向 GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 131
反向 ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA
采用流式细胞术检测。取对数生长期的 5 种细胞，
5
按 1×10 个/孔接种至 6 孔板中，分为对照组、仑伐替尼 经浓度测定后进行变性处理；取变性蛋白适量，进行凝
组（10 μmol/L）、EGCG+仑伐替尼组（10 μg/mL EGCG+ 胶电泳分离并转膜，以封闭液封闭 1 h；加入 PI3K、Akt、
10 μmol/L仑伐替尼），每组设置3个复孔（EGCG质量浓 p-PI3K、p-Akt、mTOR、Bcl-2、cleaved caspase-3、β -actin
度参考“2.2”“2.3”项下实验结果设置）。培养48 h后，收 一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶
集各组细胞，每孔加入50 μmol/L的EdU染液适量，染色 2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000），于 4 ℃下孵
2 h；收集细胞并重悬，加入阿波罗染液适量，染色 10 育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶2 000），
min；弃去染液，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染 于室温下孵育2 h；洗膜后，显色、成像。使用Image J软
液，避光染核 5～10 min；收集细胞并重悬，使用流式细 件，以β-actin为内参，计算各目的蛋白的表达水平，并以
胞仪于激发波长 488 nm 下检测各组 EdU 阳性细胞（呈 p-PI3K 与 PI3K、p-Akt 与 Akt 的灰度值比值表示 PI3K、
橙色荧光）占比，以评估细胞增殖率。 Akt蛋白的磷酸化水平。
2.5 EGCG联合仑伐替尼对细胞侵袭能力的影响 2.6.3 PTEN、caspase-3蛋白定位检测
采用 Transwell 实验检测。取对数生长期的 5 种细 采用免疫荧光技术检测。取对数生长期的 5 种细
5
4
胞，按5×10 个/孔接种至预先用基质胶处理的Transwell 胞，按 1×10 个/孔接种至 6 孔板中，按“2.4”项下方法分
小室上室；将含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基 600 μL 组、处理。培养至细胞贴壁24 h后，更换培养基；继续培
加至下室。上室细胞按“2.4”项下方法分组、处理。培养 养 48 h 后，收集各组细胞并制成涂片，经预冷的甲醇固
48 h 后，收集穿膜细胞，以 4% 多聚甲醛溶液固定 30 定后再用预冷的PBS清洗10 min；于室温下封闭30 min
min，再用 0.1% 结晶紫于室温下染色 20 min，在显微镜 后，加入PTEN、caspase-3一抗（稀释比例均为1∶1 000），
下随机选取4个视野观察，使用Image J软件统计细胞侵 于4 ℃下孵育过夜；清洗后，加入相应二抗（稀释比例均
袭数（侵袭细胞呈紫色）。 为1∶2 000），于室温下孵育1 h；清洗后，加入DAPI染液
2.6 细胞中 PI3K/Akt 信号通路相关 mRNA 及蛋白表 适量，于室温下避光孵育 5 min；加入封片剂适量，使用
达检测 显微镜观察目的蛋白的分布情况，并使用 Image J 软件
2.6.1 通路相关mRNA表达检测 分析其相对荧光强度（PTEN呈绿色荧光，caspase-3呈红
采用 RT-qPCR 法检测。取对数生长期的 HepG2 细 色荧光），以评估PTEN、caspase-3蛋白的表达情况。
5
胞，按 1×10 个/孔接种至 6 孔板中，按“2.4”项下方法分 2.7 激活 PI3K/Akt 信号通路对 EGCG 增敏作用的影
组、处理。培养 48 h 后，收集各组细胞，提取 RNA，经浓 响检测
度、纯度测定后，将其逆转录为cDNA。以此cDNA为模 本研究通过加入 PI3K 激动剂进一步探讨 EGCG 增
板，进行PCR扩增。PCR反应体系按相应试剂盒说明书 强肝癌细胞对仑伐替尼敏感性是否与 PI3K/Akt 信号通
配制。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 路有关，具体操作如下：取对数生长期的HepG2细胞，按
5
s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 39 个循环。以甘油醛-3-磷酸 1×10 个/孔接种至 6 孔板中，分为对照组、仑伐替尼组
脱氢酶（GAPDH）为内参，采用 2 －ΔΔCt 法计算各目的基因 （10 μmol/L）、EGCG+仑伐替尼组（10 μg/mL EGCG+10
的相对表达水平。引物序列及产物大小见表1。 μmol/L仑伐替尼）和EGCG+仑伐替尼+IGF-1（10 μg/mL
2.6.2 通路相关蛋白表达检测 EGCG+10 μmol/L 仑伐替尼+50 ng/mL IGF-1 [1,19] ），每组
采用 Western blot 法检测。收集“2.6.1”项下各组细 设置3个复孔。培养48 h后，按“2.3”～“2.5”项下方法检
胞，经裂解后，以12 000 r/min离心10 min，收集上清液， 测各组的克隆形成数、细胞增殖率、细胞侵袭数。

· 2258 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 18 中国药房 2025年第36卷第18期