Page 43 - 《中国药房》2025年18期
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肝癌是常见且致命的恶性肿瘤之一，我国肝癌新发                         Mini 试剂盒（批号 DP430）购自天根生化科技（北京）有
                                                                              TM
          病例和死亡病例分别占全球病例总数的 48%、42%                  [1―2] 。  限公司；PrimeScript 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex‐
          据统计，39.0%～53.6% 的肝癌患者在初诊时已处于晚                      Taq 试剂盒（批号分别为 RR064A、RR420A）均购自南京
          期，其治疗以全身治疗为主            [3―4] 。仑伐替尼是肝癌治疗           诺唯赞生物科技股份有限公司；CCK-8 试剂盒（批号
          的一线靶向药物，可通过抑制肿瘤血管生成来显著延缓                           C0038）购自上海碧云天生物技术有限公司；EdU细胞增
          肝癌进展，改善患者预后          [5―6] 。然而临床实践显示，肝癌            殖检测试剂盒（批号 KGA9602）购自江苏凯基生物技术
                              [7]
          细胞易对仑伐替尼耐药 ，耐药的发生与细胞中显著活                           股份有限公司；结晶紫染色液（批号 C432890）购自上海
          化 的 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphoinositide  3-kinase，    阿拉丁生化科技股份有限公司；兔抗 PI3K、Akt、磷酸化
          PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，又称“Akt”）信号通          PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、β-肌动蛋白（β-ac‐
          路密切相关。因此，靶向该通路有望增强肝癌细胞对药                           tin）抗体（批号分别为 4292、9272、4228、4967）均购自美
                                             [8]
          物的敏感性，提高仑伐替尼的抗肝癌效果 。                               国 CST 公司；兔抗磷酸化 Akt（phosphorylated Akt，p-
              表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gal‐             Akt）、剪切的胱天蛋白酶 3（cleaved caspase-3）抗体（批
          late，EGCG）是源自绿茶的类黄酮化合物，可抑制多种肿                      号分别为 66444-1-IG、25128-1-AP）均购自美国 Protein‐
          瘤细胞的增殖和血管生成，并可诱导其凋亡                  [9―10] 。此外，   tech 公司；兔抗 B 细胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma-2，Bcl-
          EGCG可通过调控胞外信号调节激酶、促分裂原活化的                          2）、PTEN、caspase-3 抗 体 和 山 羊 抗 兔 免 疫 球 蛋 白 G
          蛋白激酶等多条信号通路来调节第 10 号染色体缺失的                        （IgG）二抗 H&L（辣根过氧化物酶）、山羊抗兔 IgG 二抗
                                                                            ®
          磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homo‐           H&L（Alexa Fluor  488）、驴抗兔 IgG 二抗 H&L（Alexa
                                                                 ®
          logue deleted on chromosome 10，PTEN）的表达、抑制         Fluor  647）（批号分别为 ab182858、ab226801、ab32351、
          Akt 的磷酸化、下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mamma‐                      ab6721、ab150077、ab150075）均购自艾博抗（上海）贸易
          lian target of rapamycin，mTOR）的表达，最终抑制肿瘤           有限公司；DMEM 培养基（批号 SH30243.01）购自美国
          细胞的生长、促进其凋亡          [11―14] 。PI3K/Akt 信号通路在肝      Hyclone 公 司 ；胎 牛 血 清（批 号 10099-141）购 自 美 国
          癌进展及肝癌细胞耐药发生过程中具有关键作用，且                            Gibco 公司；PCR 相关引物由北京擎科生物科技股份有
          EGCG对该通路的调控作用已得到初步证实                 [15―16] 。已有   限公司提供。
          研究表明，EGCG能够逆转肝癌细胞对索拉非尼的耐药                          1.3 细胞
          性，并可调控肝癌细胞耐药基因的表达                   [17―18] 。然而，       人肝癌细胞系 HepG2、Huh-7 细胞（批号分别为
          EGCG 能否增强肝癌细胞对仑伐替尼的敏感性尚未可                          SCSP-510、SCSP-526）均购自中国科学院典型培养物保
          知。基于此，本研究拟从 PI3K/Akt 信号通路出发，在细                     藏委员会细胞库；人肝癌细胞系 SMMC-7721、SNU-368
          胞层面探讨 EGCG 能否增强肝癌细胞对仑伐替尼的敏                         细胞（批号分别为 C6865、C6873）均购自上海碧云天生
          感性，并分析其潜在机制，以期为肝癌患者的临床治疗                           物 技 术 有 限 公 司 ；人 肝 癌 细 胞 SNU-739 细 胞（批 号
          提供参考。                                              00739）购自生物风国际试剂进口出口物流中心。所有
          1 材料                                               细胞均于－80 ℃下冷冻备用。
          1.1 主要仪器                                           2 方法
              本研究所用主要仪器包括 Tecan Sunrise 型全自动                 2.1 肝癌细胞培养与处理
          酶标仪（瑞士 Tecan 公司），FACSVerse 型流式细胞仪                      将 HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-368、SNU-739
         （美国 BD 公司），N-SIM/N-STORM 型超分辨率显微镜                   细胞接种至含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，于
                                         TM
         （日本 Nikon 公司），Thermo Scientific  BB150 型细胞培         37 ℃、5%CO2条件下培养、传代。后续指标检测实验
          养箱、QuantStudio 6 Flex型实时荧光定量聚合酶链式反                 中，细胞培养均采用不含血清的DMEM培养基。
          应（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）仪、XCell Sure‐  2.2 EGCG联合仑伐替尼对肝癌细胞存活率的影响
          Lock Mini-Cell 型电泳槽（美国 Thermo Fisher Scientific        采用CCK-8实验检测。取对数生长期的5种细胞，
                                                                    3
          公司），ChampChemi610 plus 型化学发光荧光凝胶成像                 按 1×10 个/孔接种至 96 孔板中，培养 24 h 后分为对照
          系统（北京森西赛智科技有限公司）等。                                 组、仑伐替尼组（10 μmol/L）和不同质量浓度 EGCG+仑
          1.2 主要药品和试剂                                        伐替尼组（1、5、10 μg/mL EGCG+10 μmol/L仑伐替尼），
              EGCG 原料药（批号 HY-13653，纯度 99.75%）、仑伐             同时设置不含细胞、药物的空白组。每组设置3个复孔
                                                                                       [19]
          替尼原料药（批号HY-10981，纯度99.85%）、PI3K激动剂                （各药物组浓度参考相关文献 设置）。培养48 h后，弃
          胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）      去培养基，加入 10%CCK-8 试剂，避光孵育 1 h 后，使用
          的原料药（批号 HY-P7018，纯度≥98%）、兔抗 mTOR 抗                 酶标仪检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞存活率：
          体（批号 YA281）均购自美国 MCE 公司；RNeasy Plus                细胞存活率＝（实验组 OD 值－空白组 OD 值）/（对照组


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2257 ·
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