Page 38 - 《中国药房》2025年18期
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2 方法                                                检测其中SOD含量，所有操作严格按照相应试剂盒说明
          2.1 分组、造模与给药                                        书进行。
              随机选择 10 只大鼠，作为对照组；另取 65 只大鼠，                    2.5 肺组织病理学变化观察
          通过吸入香烟烟雾+气管滴注内毒素+鼻腔给菌的方式                                收集各组大鼠的右肺中叶组织，取适量，置于 10%
                               [3]
          建立 AECOPD 大鼠模型 ，具体操作如下：分别在实验                        福尔马林溶液中固定，经梯度乙醇脱水后，行常规石蜡
          第 1、14、28 天麻醉大鼠后，使用导管通过其喉部向肺内                       包埋、切片；取切片，脱蜡后，依次进行苏木精、伊红染
          滴注 1 g/L 的内毒素 0.2 mL（以生理盐水为溶剂），然后                   色；以中性树胶封片，使用光学显微镜观察肺组织病理
          轻轻摇晃大鼠以确保内毒素在其肺部均匀分布；分别在                            学变化，并进行病理学评分，即炎症细胞浸润（0～3分）、
          实验第 2～13、15～27 天将大鼠置于玻璃熏箱（50 cm×                    肺泡结构受损（0～3分）、支气管上皮损伤（0～3分）3个
                                                                                                     [15]
          40 cm×40 cm）中，使其暴露于香烟烟雾中30 min；在实                   维度的评分之和，分值越高表示肺损伤越严重 。
                                               9
          验第29～32天，在大鼠鼻腔内滴注2.4×10  cfu/mL的金                   2.6 肺组织中Muc5ac蛋白表达检测
          黄色葡萄球菌菌液0.3 mL（以生理盐水为溶剂），以建立                            采用免疫组化法检测。取“2.5”项下各组大鼠的肺
          AECOPD 大鼠模型。若大鼠出现打喷嚏、呼吸急促、体                         组织切片，经脱蜡、抗原修复后，加入Muc5ac一抗（稀释
          温升高、肺功能指标异常等，则判断为 AECOPD 模型制                        比例为1∶500），于4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗（稀释
          备成功。                                                比例为 1∶1 000），于 37 ℃下孵育 1 h，以 3，3′-二氨基联
              将造模成功的 50 只大鼠随机分为 AECOPD 组，白                    苯胺显色后，再以苏木精复染，经分化、返蓝后封片，使
          花丹素低、高剂量组（白花丹素-低组、白花丹素-高组），                         用倒置显微镜观察并使用Image J软件定量分析Muc5ac
          阳性对照组，白花丹素高剂量+Jagged1组（白花丹素-高                       蛋白的阳性表达（呈棕黄色）情况，以阳性区域面积占观
          +Jagged1组），每组10只。其中，白花丹素-低组、白花丹                     察视野总面积的百分比表示Muc5ac蛋白的表达量。
          素-高组大鼠分别灌胃白花丹素 10、50 mg/kg（以二甲基                     2.7 肺组织中Notch1、GATA3蛋白表达检测
          亚砜为溶剂，剂量参考预实验及相关文献 设置），并腹                               采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组大鼠的
                                              [12]
          腔注射等体积生理盐水；阳性对照组大鼠灌胃地塞米松                            右肺下叶组织适量，裂解后提取总蛋白，经BCA法测定
          0.09 mg/kg（以二甲基亚砜为溶剂，剂量参考预实验及相                      浓度后进行变性处理。取变性蛋白适量，经凝胶电泳分
          关文献 设置），并腹腔注射等体积生理盐水；白花丹素-                          离 后 转 膜 ，以 5% 脱 脂 牛 奶 封 闭 2  h；洗 膜 后 ，加 入
                [13]
          高+Jagged1组大鼠灌胃白花丹素50 mg/kg，并腹腔注射                    Notch1、GATA3、β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），
          Jagged1 25 mg/kg（以二甲基亚砜为溶剂，剂量参考预实                   于 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
                      [14]
          验及相关文献 设置）；对照组和 AECOPD 组大鼠灌胃                        1∶2 000），于室温下孵育 1～2 h；洗膜后，以增强型化学
          并腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，连续28 d。                           发光试剂显色后成像。采用Image J软件检测各蛋白条
          2.2 肺功能检测                                           带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值
              末次给药后，麻醉各组大鼠，以仰卧位固定，在其颈                         比值表示各目的蛋白的相对表达量。
          部中央作一切口，暴露气管并插管，再与动物肺功能测                            2.8 统计学方法
          试仪连接，测量并记录呼气流量峰值（peak expiratory                        采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。实验数
          flow，PEF）、0.3 s 用力呼气容积（forced expiratory volume     据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          in 0.3 seconds，FEV0.3 ）与用力肺活量（forced vital capacity，  步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          FVC）比值（FEV0.3/FVC）。                                 3 结果
          2.3 支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数与炎症因子检测                           3.1 白花丹素对大鼠肺功能指标的影响
              肺功能检测结束后，从各组大鼠气管插管处缓慢注                              与对照组比较，AECOPD 组大鼠 PEF、FEV0.3/FVC
          入磷酸盐缓冲液（PBS），灌洗左肺，随后回收相应的支气                         均显著降低（P＜0.05）；与 AECOPD 组比较，白花丹素-
          管 肺 泡 灌 洗 液（bronchoalveolar  lavage  fluid，BALF）2   低组、白花丹素-高组、阳性对照组大鼠上述指标均显著
          mL，以2 000 r/min离心10 min后，取上清液。使用光学                  升高，且白花丹素-高组、阳性对照组均显著高于白花丹
          显微镜观察并记录白细胞总数和淋巴细胞数、中性粒细                            素-低组（P＜0.05）；与白花丹素-高组比较，白花丹素-高+
          胞数、巨噬细胞数；使用酶标仪以ELISA法检测其中IL-                        Jagged1 组大鼠上述指标均显著降低（P＜0.05）。结果
          6、IL-10、TNF-α 水平，所有操作严格按照相应试剂盒说                     见表1。
          明书进行。                                               3.2 白花丹素对大鼠 BALF 中炎症细胞数和炎症因子
          2.4 肺组织中氧化应激指标检测                                    水平的影响
              收集BALF 后，将各组大鼠处死，打开胸腔，暴露肺                           与对照组比较，AECOPD组大鼠BALF中白细胞总
          部，收集其右肺下叶组织适量，匀浆后，使用酶标仪以硫                           数及淋巴细胞数、中性粒细胞数、巨噬细胞数均显著升
          代巴比妥酸法检测其中 MDA 含量，以黄嘌呤氧化酶法                          高（P＜0.05）；与AECOPD组比较，白花丹素-低组、白花


          · 2252 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18                            中国药房  2025年第36卷第18期
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