Page 26 - 《中国药房》2025年18期

细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次，再以预冷的甲醇 次，连续 27 d。给药期间，每 3 d 称定裸鼠体重、测量瘤
固定15 min；移除甲醇，细胞以0.1%结晶紫染液染色10 体长/宽度各 1 次，计算瘤体体积（瘤体体积＝肿瘤长
min；移除染液，细胞以水洗涤2次，静置，干燥后，使用显 度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2）。末次给药后次日，予CO2
微镜观察各组细胞的克隆形成情况，记录克隆数（大于 吸入处死各组裸鼠，取出其瘤体，称重后计算抑瘤率[抑
50个细胞的集落计为1个克隆）并计算克隆形成率[克隆 瘤率（%）＝（对照组裸鼠瘤重－药物组裸鼠瘤重）/对照
形成率（%）＝克隆数/细胞接种数×100%]。 组裸鼠瘤重×100%]。
2.1.4 HepG2细胞凋亡情况检测 2.2.2 肿瘤组织中 Ki-67、cleaved caspase-3 蛋白表达
取对数生长期的 HepG2 细胞，以 5×10 个/孔接种 检测
5
于 6 孔板中，培养 24 h 后，按“2.1.3”项下方法分组，每组 采用免疫组化法检测。取“2.2.1”项下各组裸鼠肿
设置3个复孔。各组以（含药）培养基培养24 h后，收集 瘤组织，经常规脱水后进行石蜡包埋，制作石蜡切片；取
细胞，以 0.25% 胰酶消化，经预冷的 PBS 洗涤 2 次，以 切片，经脱蜡水化、柠檬酸修复、3% 过氧化氢阻断内源
binding buffer 200 μL 重悬，分别加入 Annexin Ⅴ-FITC 性过氧化物酶活性10 min后，加入牛血清白蛋白于室温
试剂、PI试剂各5 μL，混匀后避光孵育15 min，使用流式 下封闭30 min；加入增殖相关蛋白Ki-67、凋亡效应因子
细胞仪检测各组细胞的凋亡率。 cleaved caspase-3 一抗（稀释比例均为 1∶400），于 4 ℃下
2.1.5 HepG2 细胞中 Fas/FasL 信号通路相关蛋白表达 孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶200），于室温下
检测 孵育50 min；用PBS洗涤后，以二氨基联苯胺试剂显色，
采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 HepG2 再以苏木精复染、乙醇脱水、二甲苯透明，用中性树胶封
细胞，按“2.1.4”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集 片后，使用显微镜观察各组细胞阳性染色（呈棕褐色）情
细胞并分离总蛋白，经浓度测定后于95 ℃下加热5 min 况，采用 Image J 软件分析阳性染色区域的平均光密度
进行热变性处理。取变性蛋白样品，经十二烷基硫酸 值，以表示Ki-67、cleaved caspase-3蛋白的表达水平。
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以半干转法转移至聚 2.3 统计学方法
偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂牛奶于室温下封闭 1 h；洗 采用 GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计分
膜后，加入 Fas、FasL、cleaved caspase-8、cleaved caspase- 析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
3、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过 分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶5 000），于室 α＝0.05。
温下孵育 60 min；洗膜后，以增强化学发光底物（ECL） 3 结果
显影、成像，并使用Image J软件分析各目的蛋白的条带 3.1 细胞实验结果
灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值 3.1.1 细胞及药物干预条件筛选结果
表示目的蛋白的表达水平。 与对照组比较，经1～32 μmol/L的PP9干预24、48、
2.1.6 Fas抑制剂干预对PP9抗肿瘤活性的影响检测 72 h 后，HepG2、SMMC-7721、Bel-7404 细胞的存活率均
5
另取对数生长期的 HepG2 细胞，以 5×10 个/孔接 显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。干预 24 h 时，PP9 对
种于 6 孔板中，培养 24 h 后，将其分为对照组、PP9 组（4 HepG2、SMMC-7721、Bel-7404 细胞的 IC50分别为 4.08、
μmol/L）、KR-33493组（10 μmol/L，浓度参考相关文献 [15] 7.44、9.91 μmol/L，提示 PP9 对 HepG2 细胞的体外抑制
设置）和 PP9+KR-33493（4 μmol/L PP9+10 μmol/L KR- 效果更好。基于此，后续研究以更为敏感的HepG2细胞
33493）组，每组设置 3 个复孔。各组以（含药）培养基培 作为对象，药物浓度分别为2、4 μmol/L；此外，考虑到药
养 24 h 后，收集细胞，按“2.1.5”项下方法检测各组细胞 物作用 24 h 即有明显的效果，故将干预时间设为 24 h。
中 Fas、FasL、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3 蛋白的 结果见图1（以HepG2细胞为例）。
表达水平。 100
24 h
2.2 动物实验 48 h
80 a a
2.2.1 造模、分组与给药 a a 72 h
取对数生长期的HepG2细胞，用PBS配制成单细胞 存活率/% 60 a a
7
悬液，按 1×10 个/只接种于裸鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤 40 a a a
a a a
3
体积达到 50 mm 时即为荷瘤裸鼠模型构建成功。将造 20
a a a
模成功的裸鼠随机分为对照组、5-Fu 组（阳性对照，20 0 a a a
mg/kg）和 PP9 组（10 mg/kg），每组 6 只。各药物组剂量 0（对照） 5 10 15 20 25 30
PP9浓度/（μmol/L）
[7]
参考预实验结果及相关文献 设置，以生理盐水为溶剂。 a：与对照组比较，P＜0.01。
各组裸鼠均腹腔注射生理盐水或相应药液，每3 d注射1 图1 PP9对HepG2细胞存活率的影响（x±s，n＝5）
· 2240 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 18 中国药房 2025年第36卷第18期