Page 61 - 《中国药房》2025年16期
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2 方法                                               2.7 肝组织中 TLR4/MyD88/NF-κB、AMPK/SREBP-
          2.1 BRP的制备                                         1c信号通路相关蛋白表达检测
              BRP 的提取参照文献[6]方法，并略加修改：将芜菁                         采用 Western blot 法检测。取“2.3”项下空白组、模
          冻干片打成粉后，称取一定量粉末，采用水提法，按1∶32                        型组和BRP各剂量组小鼠冻存的肝组织各20 mg（每组
         （g/mL）的比例加入蒸馏水，在提取温度 92 ℃下回流提                       各取 3 只小鼠的样本），加入组织裂解液，提取总蛋白。
          取 2.3 h，取上清液；55 ℃减压浓缩后加入 4 倍量 95% 乙                采用BCA法测定总蛋白浓度。沸水浴10 min使蛋白变
          醇，4 ℃醇沉 12 h，以 8 000 r/min 离心 10 min；取沉淀经          性后，取 10 μL 蛋白样品上样进行电泳分离（电压 160
          活性炭脱色、Sevage 法脱蛋白后，取上清液于截留分子                       V，电泳时间40 min），然后转移（电压25 V，转膜时间30
          量为 3 500 Da 的透析袋中透析，真空冷冻干燥后即得                      min）至聚偏二氟乙烯膜上，在快速封闭液中封闭；加入
                             [6]
          BRP。经苯酚-硫酸法 测定，BRP 中多糖质量分数为                        TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、AMPK、p-AMPK、
          72.52%。                                            SREBP-1c、GAPDH 一抗（稀释比例分别为 1∶4 000、
          2.2 分组与造模                                          1∶10 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、
              C57BL/6J 小鼠适应性喂养 1 周后，将其随机分成 6                 1∶50 000），于4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例
          组，即空白组、模型组、联苯双酯组（阳性对照）和 BRP                        为1∶5 000），于37 ℃下孵育1 h；使用ECL发光液显影，
          低、中、高剂量组，每组12只。联苯双酯组小鼠灌胃300                        置于化学发光成像系统中成像。使用Image J软件分析
                       [11]
          mg/kg联苯双酯 ，BRP低、中、高剂量组小鼠分别按75、                     各 蛋 白 条 带 的 灰 度 值 ，以 目 标 蛋 白 与 内 参 蛋 白
          150、300 mg/kg 灌胃 BRP（剂量根据前期预实验结果设                 （GAPDH）条带灰度值的比值表示目标蛋白的表达
          置），空白组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。所有                           水平。
          小鼠均每天给药1次，连续9 d。末次给药4 h后，除空白                       2.8 肠道内容物16S rRNA高通量测序
          组小鼠灌胃 15 mL/kg 蒸馏水外，其余各组小鼠均灌胃                          取“2.3”项下空白组、模型组和BRP中剂量组（该组
                                              [12]
          15 mL/kg 56度白酒建立酒精性肝损伤模型 。建模后，                     小鼠的药效结果最好）小鼠肠道内容物（每组各取6只小
          模型组有2只小鼠死亡；剔除所有组（包括模型组）的异                          鼠的内容物），寄送至上海美吉生物医药科技有限公司
          常个体后，最终每组保留8只小鼠用于后续实验。                             进行 16S rRNA 高通量测序。根据 DNA 提取试剂盒说
          2.3 样本取材及处理                                        明书操作要求进行总DNA的提取后，对其16S rRNA基
              建模后小鼠禁食不禁水，12 h后摘眼球取血，离心，                      因 V3～V4 可变区实施 PCR 扩增，上游引物为 338F
          取上清液。取血后，颈椎脱臼处死小鼠并解剖，取结肠                          （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′），下游引物为
          内容物、结肠组织和肝组织。将结肠内容物和部分肝组                           806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT-AAT-3′），扩增产
          织置于液氮中速冻后，放入－80 ℃冰箱中保存，备用；将                        物长度为468 bp。对PCR扩增产物进行纯化，构建文库
          结肠组织和另一部分肝组织存放于组织固定液中，用于                           并质检，将质检合格的文库使用 Illumina 高通量测序仪
          病理学观察。                                             进行测序。
          2.4 血清中肝功能指标测定                                     2.9 肝脏代谢组学检测
              取“2.3”项下各组小鼠血清，按照相应试剂盒说明书                          取“2.3”项下空白组、模型组和BRP中剂量组（该组
          方法操作，使用酶标仪测定小鼠血清ALT、AST水平。                         小鼠的药效结果最好）小鼠冻存的肝组织（每组各取6只
          2.5 肝组织中脂代谢、炎症指标测定                                 小鼠的样本），寄送至上海美吉生物医药科技有限公司
              取“2.3”项下冻存的肝组织适量，常规解冻后，按照                      进行超高效液相色谱-串联质谱联用技术检测。取 50
          试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪检测小鼠肝组织中                           mg 肝组织，经研磨、提取、静置后，移取上清液上机分
          脂代谢指标（TG、TC、LDL-C）和炎症指标（IL-6、IL-1β、                析。色谱条件：采用 HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，
          TNF-α、LPS）水平。                                      1.8 µm），以 5% 乙腈-95% 水溶液（含 0.1% 甲酸）为流动
          2.6 肝和结肠组织病理学检测                                    相 A、47.5% 乙腈-47.5% 异丙醇-5% 水溶液（含 0.1% 甲
              取“2.3”项下组织固定液固定的各组小鼠的肝组织                       酸）为流动相 B 进行梯度洗脱（正离子模式——0～3.0
          和结肠组织，分别常规制备石蜡切片（厚 4～5 μm），进                       min，100%A→20%B；3.0～4.5 min，20%B→35%B；4.5～
          行HE染色、封片后，采用光学显微镜观察小鼠肝组织和                          5.0 min，35%B→100%B；5.0～6.3 min，100%B；6.3～6.4
          结肠组织病理学形态变化并拍照。                                    min，100%B→100%A；6.4～8.0 min，100%A。负离子
              另取一部分组织固定液固定的各组小鼠的肝组织，                         模 式 ——0～1.5  min，100%A→20%B；1.5～2.0  min，
          经脱水、OTC 包埋剂包埋后，冰冻切片（厚 8～10 μm），                    20%B→10%B；2.0～4.5 min，10%B→30%B；4.5～5.0 min，
          然后经固定、油红 O 染色、分化、复染后用甘油明胶封                         30%B→100%B；5.0～6.3  min，100%B；6.3～6.4  min，
          片，采用光学显微镜观察染色结果并拍照。                                100%B→100%A；6.4～8.0  min，100%A）；流 速 为 0.40


          中国药房  2025年第36卷第16期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16    · 2007 ·
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