Page 56 - 《中国药房》2025年16期
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组的剂量按照 60 kg 成人日剂量，根据人与动物体表面                        11 200 r/min离心20 min，收集上清液，以BCA法定量后
          积折算系数计算，为 1.24 g/kg；分别以中剂量的 1/2 和 2                 进行变性处理。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸
          倍作为低、高剂量，即 0.62、2.48 g/kg。阳性对照组大鼠                   钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭；洗膜后，加入
          皮下注射地舒单抗 3 mg/kg[以柠檬酸钠缓冲液（0.1                       RANKL、RANK、OPG、β-tubulin 一抗（稀释比例分别为
          mmol/L）为溶剂]。空白对照组和模型组灌胃等体积生                         1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶2 000），孵育过夜；洗膜后，
          理盐水，对照组大鼠灌胃等体积柠檬酸钠缓冲液（0.1                           加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），孵育2 h；洗膜后，
          mmol/L），每天1次，连续8周。                                  以增强型 ECL 试剂显色、成像，以目的蛋白与内参蛋白
          2.2 考察指标                                           （β-tubulin）的灰度值比值作为各目的蛋白的相对表
          2.2.1 左股骨BMD测量
                                                              达量。
              末次给药后，随机选取各组大鼠5只，使用全自动双
                                                              2.3 统计学方法
          能X线骨密度测量仪对其左股骨进行高精度扫描，测量
                                                                  采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。实验数
          其BMD。                                               据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          2.2.2 血清骨代谢相关指标
                                                              步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
              取“2.2.1”项下各组大鼠，经腹腔注射 2% 戊巴比妥
          钠麻醉后，取其股动脉血，于4 ℃下以3 000 r/min离心5                    3 结果
                                                              3.1 各组大鼠左股骨BMD比较
          min，分离血清，使用酶标仪检测其血清OC、钙、磷水平，
          紫外-可见分光光度计检测其血清 ALP、TRAP 活性，严                           与空白对照组、对照组大鼠比较，模型组大鼠BMD
          格按照相应试剂盒说明书操作。                                      显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，金匮肾气丸中、高
          2.2.3 股骨组织病理学观察                                     剂量组和阳性对照组大鼠BMD均显著升高（P＜0.05），
              取各组剩余大鼠，同法麻醉后处死，取其右股骨组                          且三者作用相当（P＞0.05）。结果见表1。
          织，经 10% 乙二胺四乙酸脱钙、4% 甲醛固定后，行常规                       表1 各组大鼠 BMD 和血清骨代谢相关指标比较（x±
          石蜡包埋、切片。取切片，经苏木精-伊红（HE）染色后，                              s，n＝5）
          使用显微镜观察大鼠股骨组织的病理学变化。                                组别        BMD/（g/cm） OC/（ng/L） 钙/（mmol/L） 磷/（mmol/L） ALP/（U/mL）TRAP/（μg/L）
                                                                             2
          2.2.4 左股骨组织中RANKL、RANK、OPG mRNA表达                   空白对照组     0.35±0.02 10.39±1.87 1.56±0.17  1.52±0.18  8.34±1.79  4.76±1.08
                                                              对照组       0.36±0.02 10.68±1.95 1.58±0.17  1.53±0.14  8.25±1.74  4.81±1.06
          检测
                                                              模型组       0.30±0.03 19.94±3.03 2.16±0.49 ab  2.04±0.42 ab  6.82±2.17 ab  9.52±2.33 ab
                                                                             ab
                                                                                   ab
              采用实时荧光定量 PCR 法检测。取“2.2.3”项下各                    金匮肾气丸低剂量组 0.31±0.01 16.12±1.15 1.88±0.23  1.85±0.27  6.78±2.01  8.14±1.86
                                                                                   c
                                                                                   cd
                                                                             cd
          组大鼠的左股骨组织适量，提取其总RNA，经浓度、纯度                          金匮肾气丸中剂量组 0.34±0.01 14.07±1.06 1.79±0.35 c  1.64±0.31 c  7.41±0.99 cd  7.29±0.91 c
                                                              金匮肾气丸高剂量组 0.35±0.03 12.62±1.31 1.63±0.16 cd  1.59±0.25 cd  7.97±1.95 cd  5.76±0.83 cde
                                                                             cd
                                                                                   cd
          检测后，将其逆转录为cDNA。以此cDNA为模板，进行
                                                                                   cd
                                                              阳性对照组     0.36±0.03 12.45±1.22 1.61±0.11 cd  1.58±0.24 cd  7.99±1.83 cd  5.68±0.77 cde
                                                                             cd
                                                   [13]
          PCR扩增。所用引物由本课题组参考相关文献 设计：
                                                                 a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与对照组比较，P＜0.05；c：与模
          RANKL 的正、反向引物分别为 5′-TGGAGAGCGAA-
                                                              型组比较，P＜0.05；d：与金匮肾气丸低剂量组比较，P＜0.05；e：与金匮
          GACACAGA-3′、5′-CAGACTGACTTTATGGGAACC-3′，            肾气丸中剂量组比较，P＜0.05。
          RANK 的正、反向引物分别为 5′-GGCTGGCTACCAC-                   3.2 各组大鼠血清骨代谢指标比较
          TGGAACT-3′、5′-TCCTGTAGTAAACGCCGAAGA-3′，
                                                                  与空白对照组、对照组比较，模型组大鼠血清 OC、
          OPG 的正、反向引物分别为 5′-CGAAAGCACCCTG-                    钙、磷水平及 TRAP 活性均显著升高，而 ALP 活性显著
          TAGGAA-3′、5′-TGTCCACCAGAACACTCAGC-3′，
                                                              降低（P＜0.05）。与模型组比较，金匮肾气丸中、高剂量
          β-tubulin 的正、反向引物分别为 5′-GTTCCGGTTCAA-
                                                              组和阳性对照组大鼠上述指标以及金匮肾气丸低剂量
          GTGGGTCA-3′、5′-CCACACTTCATGAGCAGGCT-3′。
                                                              组大鼠血清 OC 水平均显著改善，呈一定的剂量依赖趋
          PCR反应体系为：cDNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0
                                                              势（P＜0.05），其中高剂量金匮肾气丸的作用与阳性对
          μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，
                                                              照药相当（P＞0.05）。结果见表1。
          10×PCR 缓冲液 2.5 μL，25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 μL，
                                                              3.3 各组大鼠股骨组织病理学变化
          以 ddH2O 补至 25 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性3
                                                                  空白对照组和对照组大鼠右股骨组织中骨小梁排
          min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共 35
          个循环；72 ℃再延伸 5 min。以 β-tubulin 为内参，采用                列整齐，结构完整，呈致密网状结构。模型组和金匮肾
          2 －ΔΔCt 法计算 RANKL、RANK、OPG mRNA 的相对表达               气丸低剂量组大鼠骨小梁结构明显受损，大量骨小梁断
          量，结果以空白对照组为标准进行归一化处理。                               裂，骨组织可见明显间隙，但金匮肾气丸低剂量组略好
          2.2.5 左股骨组织中 RANKL、RANK、OPG 蛋白表达                    于模型组。金匮肾气丸中、高剂量组和阳性对照组大鼠
          检测                                                  骨小梁数量较模型组和金匮肾气丸低剂量组有所增加，
              采用 Western blot 法检测。取“2.2.4”项下各组大鼠              但不及空白对照组和对照组，骨小梁排列较为整齐、致
          的左股骨组织适量，加入裂解液适量，于 4 ℃下以                            密。结果见图1。
          · 2002 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16                            中国药房  2025年第36卷第16期
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