Page 51 - 《中国药房》2025年16期
P. 51

表2 PCR引物序列及扩增产物长度                           NEPA-1组和TP+NEPA-2组大鼠分别单次灌胃NEPA混
          目的基因           引物（5′→3′）               产物长度/bp     悬液 25.8 mg/kg（以奈妥匹坦质量计，以生理盐水为溶
          CYP3A1         正向：TCTGTGCAGAAGCATCGAGT    92       剂） ，TP-1组和TP-2组大鼠单次灌胃等体积生理盐水；
                                                                [14]
                         反向：TCGGATAGGGCTGTATGAGATT
          CYP2C11        正向：ACACGTGGATGTCACAGCTAA  148       1 h 后，4 组大鼠均单次尾静脉注射白蛋白紫杉醇药液
                         反向：GGCATCTGGCTCCTGTCTTT             14.82 mg/kg 和顺铂药液 11.12 mg/kg（均以生理盐水为
          β-actin        正向：GACATGCCGCCTGGAGAAAC    92       溶剂） 。分别在末次给药后 0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、
                                                                  [3]
                         反向：AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
                                                             10、16、24 h 于眼内眦取血 0.3 mL 置于含肝素的离心管
             （2）Western blot 实验：取上述冻存的大鼠肝组织适
                                                                          4
                                                             中，以1.09×10  r/min离心5 min，取上层血浆，按“2.1.3”
          量，研磨后于冰上裂解，再混匀、离心。取上清液，经
                                                             项下方法处理，再按“2.1.1”项下条件进样分析，以随行
          BCA法测定含量后，于沸水浴中加热15 min使变性。取
                                                             标准曲线计算各组大鼠血浆中紫杉醇的含量。采用
          变性蛋白适量，经电泳分离后转膜，以 5% 牛奶封闭 30
                                                             DAS 2.0 软件计算药动学参数，采用 SPSS 20 软件进行
          min；洗膜后，加入 CYP3A1、CYP2C11、β-actin 一抗（稀
                                                             统计分析。其中，药时曲线下面积（AUC）、达峰浓度
          释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），4 ℃下孵育过
                                                            （cmax，即首点实测质量浓度）需经对数转换后再进行组间
          夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶5 000），室温
                                                             比较，具体统计学方法同“2.2.1（2）”项。
          下孵育 30 min；再次洗膜后，加入 ECL 试剂显影、成像。
                                                                 与 TP-1 组比较，TP+NEPA-1 组大鼠体内紫杉醇的
          使用Image J软件，用各目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的
                                                             平均 cmax、AUC0－t、AUC0－∞分别增加了 28.33%、42.46%、
          灰度值比值作为目的蛋白的表达水平，结果以Normal组
                                                             40.26%，平均表观分布容积（Vd ）、清除率（CL）分别下降
          为参照进行归一化处理。
                                                             了 35.40%、17.91%，组间比较差异均有统计学意义（P＜
             （3）检测结果：CYP3A1、CYP2C11 mRNA及蛋白表
                                                             0.05）；其平均半衰期（t1/2 ）下降了 9.54%，平均滞留时间
          达检测结果（表3、图3）显示，与Normal组比较，Model组
                                                            （MRT0－t ）延长了 3.32%，但组间差异均无统计学意义
          大 鼠 肝 组 织 中 CYP3A1  mRNA、小 肠 及 肝 组 织 中
                                                            （P＞0.05）。与 TP-2 组比较，TP+NEPA-2 组大鼠体内紫
          CYP2C11 mRNA 的表达均显著下调（P＜0.05），而其余
                                                             杉醇的平均cmax增加了23.88%，平均Vd、MRT0－t分别下降
          指标虽有下调趋势，但组间比较差异均无统计学意义
                                                             了 29.36%、30.86%，组间比较差异均有统计学意义（P＜
         （P＞0.05）。
                                                             0.05）；其平均 t1/2、AUC0－t、AUC0－∞分别下降了 33.89%、
         表3 两组小鼠体内CYP3A1、CYP2C11 mRNA及蛋白                     4.31%、4.43%，但组间比较差异均无统计学意义（P＞
               表达的比较（x±s，n＝3）
                                                             0.05）。与 TP-1 组比较，TP-2 组大鼠体内紫杉醇的平均
                小肠CYP3A1   肝CYP3A1   小肠 CYP2C11  肝CYP2C11
          组别                   肝CYP3A1              肝CYP2C11  AUC0－t、AUC0－∞、MRT0－t 分别增加了 35.06%、35.09%、
                 mRNA    mRNA          mRNA   mRNA
          Normal组  1.00±0.49  1.00±0.19  1.00±0.11  1.00±0.37  1.00±0.06  1.00±0.26  59.72%，平均 CL 下降了 25.97%，组间比较差异均有统
          Model组  0.90±0.21  0.57±0.08 a  0.81±0.20  0.52±0.12 a  0.54±0.14 a  0.72±0.04
                                                             计学意义（P＜0.05）；其平均 t1/2、Vd分别增加了 36.84%、
             a：与Normal组比较，P＜0.05。
                                                             0.93%，平均cmax下降了1.26%，但组间比较差异均无统计
                                                             学意义（P＞0.05）。与 TP-1 组比较，TP+NEPA-2 组大鼠
               β-actin                            52 kDa
                                                             体 内 紫 杉 醇 的 平 均 cmax、AUC0－t、AUC0－∞ 分 别 增 加
                                                  42 kDa     22.32%、29.25%、29.10%，平 均 CL、Vd 分 别 下 降 了
              CYP3A1
                                                             20.60%、28.70%，组间比较差异均有统计学意义（P＜
                                                  52 kDa
                                                             0.05）；其平均 t1/2降低了 9.54%，MRT0－t增加了 10.43%，
               β-actin
                                                  42 kDa     但组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表
                                                             4、图4。
              CYP2C11                             42 kDa
                                                             4 讨论
                        Normal组         Model组               4.1 定量分析条件的优化
         图3 两组大鼠肝组织中 CYP3A1、CYP2C11 蛋白表达                         本课题组在流动相优化过程中发现，以 0.2% 甲酸
               的电泳图
                                                             溶液-甲醇作为流动相时，紫杉醇的色谱峰峰形及响应
          2.3 药动学实验                                          均更佳，这可能是因为紫杉醇结构中缺乏氨基、羧基等
                                                                                               [15]
              另取32只大鼠，随机分为Normal组和Model组，各                   易电离基团，而加入甲酸可促进其电离 。本课题组前
          16 只；将 Normal 组大鼠随机分为 TP 化疗组（TP-1 组）、              期曾采用多西他赛作为内标，但在实践中发现，以简单
          TP 化疗+NEPA 组（TP+NEPA-1 组），将 Model 组大鼠随             的蛋白沉淀法处理尾静脉注射紫杉醇的大鼠血浆样品
          机分为 TP 化疗组（TP-2 组）、TP 化疗+NEPA 组（TP+                后，所得色谱图中内标的色谱峰较小（约为模拟血浆样
          NEPA-2 组），每组 8 只。禁食、不禁水 12 h 后 ，TP+                品的一半），不利于紫杉醇的准确定量；随后，本课题组


          中国药房  2025年第36卷第16期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16    · 1997 ·
   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56