Page 44 - 《中国药房》2025年16期
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2.3 肺组织病理情况观察                                       值比值表示目的蛋白的表达水平。
              每组随机选取 6 只大鼠的肺组织，置于 4% 多聚甲                      2.7 统计学分析
          醛中固定 24 h，经脱水、包埋、切片（4 μm）、二甲苯和梯                         采用 SPSS 18.0 软件和 GraphPad Prism 8 软件进行
          度乙醇复水处理后，行苏木精-伊红（HE）染色，中性树胶                         统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方
          封片。使用显微镜观察肺组织纤维化和炎症渗出情况。                            差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检验。检验水准
          2.4 肺组织中α--SMA表达检测                                  α＝0.05。
              采用免疫荧光技术进行测定。每组随机选取6只大                          3 结果
          鼠的肺组织，经4%多聚甲醛固定后用石蜡包埋切片，再                           3.1 大鼠MPAP和RVHI的变化
          经脱蜡、水化、抗原修复后，加入荧光淬灭剂孵育5 min，                            与对照组比较，模型组大鼠的 MPAP 和 RVHI 均显
          用牛血清白蛋白封闭 30 min，加入 α-SMA 一抗（稀释比                    著升高（P＜0.05）；与模型组比较，利舒康中、高剂量组
          例为 1∶200），4 ℃孵育过夜；次日用磷酸盐缓冲液冲洗                       和阳性对照组大鼠的 MPAP 和 RVHI 均显著降低（P＜
          后，加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔免疫球蛋白G                            0.05）；与阳性对照组比较，利舒康低、中剂量组大鼠的
          二抗（稀释比例为 1∶500），37 ℃孵育 50 min；用磷酸盐                  MPAP和RVHI均显著升高（P＜0.05）。结果见图1。
          缓冲液冲洗后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核                             50                            0.8
          后封片。使用数字切片扫描仪对荧光切片进行扫描，分                                             a             MPAP
                                                                      40      a   c  c       RVHI
          析图片中α-SMA的表达情况。                                                             bc  bc        0.6
          2.5 肺组织中HIF--1α和NF--κB mRNA表达检测                            MPAP/mmHg  30         b  b  b  b  0.4  RVHI
              采用qPCR技术进行检测。每组随机选取6只大鼠                                 20
          的肺组织（避开主支气管区域），采用 TRIzol 法提取总                               10                            0.2
          RNA，检测 RNA 纯度，并用琼脂糖凝胶电泳验证完整                                 0                             0
                                                                        对照组 模型组 利舒康 利舒康 利舒康 阳性对
          性。按第一链cDNA合成试剂盒操作合成cDNA。反应                                             低剂量 中剂量 高剂量   照组
                                                                                   组   组   组
          体系（20 μL）包含：Premix 10 μL，10 μmol/L正反向引物
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与阳性对
          各0.8 μL，cDNA模板2 μL，无核酸酶水6.4 μL。扩增条
                                                              照组比较，P＜0.05；1 mmHg＝0.133 kPa。
          件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s、60 ℃退火/延伸                 图1 各组大鼠的MPAP和RVHI比较（x±s，n＝10）
          34 s，共40个循环。引物由生工生物工程（上海）股份有                        3.2 大鼠肺组织病理变化
          限公司提供，序列与产物大小见表1。以β-actin为内参，                           对照组大鼠肺组织结构正常，小动脉内膜完整，管
          采 用 2 －ΔΔCt  法 计 算 HIF-1α 和 NF- κB  mRNA 的 表 达
                                                              壁厚度均匀，未见平滑肌层增厚。模型组大鼠则呈现明
          水平。
                                                              显的肺血管重塑，表现为肺组织的小动脉管壁显著增
                      表1 引物序列与产物大小                            厚，中膜平滑肌增生，管腔狭窄。与模型组比较，利舒康
           基因                 引物序列                产物大小/bp     低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠的肺血管重塑均不
           β-actin    正向：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3′  154
                      反向：5′-GCGGCAGTGGCCATCTC-3′              同程度改善。结果见图2。
           HIF-1α     正向：5′-ACCGCCACCACCACTGATG-3′  218
                      反向：5′-GTACCACTGTATGCTGATGCCTTAG-3′
           NF-κB      正向：5′-ACTGGGTGACATCTGCTTCTCC-3′  196
                      反向：5′-ACTCTTCTTCAGGTTCTTGGCTTCC-3′
          2.6 肺组织中HIF--1α和NF--κB p65蛋白表达检测
              采用 Western blot 技术进行检测。每组随机选取 6                      A.对照组           B.模型组        C.利舒康低剂量组
          只大鼠的肺组织约50 mg，加入预冷的RIPA裂解液充分
          匀浆，4 ℃静置30 min后，以12 000×g离心15 min，收集
          上清液。采用BCA法测定蛋白浓度并调整至4 μg/μL，
          经95 ℃变性5 min后进行电泳分离，转膜，用5%脱脂奶
          粉室温封闭2 h，分别加入稀释的HIF-1α、NF-κB p65、β-                   D.利舒康中剂量组       E.利舒康高剂量组        F.阳性对照组
          actin 一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶800、1∶5 000），             图2 各组大鼠肺组织病理变化的显微图（HE染色）
          4 ℃孵育过夜；用 TBST 缓冲液洗涤 3 次（每次 10 min），                3.3 大鼠肺组织中α--SMA表达变化
          加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白 G                                与对照组比较，模型组大鼠肺组织中 α-SMA 表达
          二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h；再次洗涤后进                    （1.65±0.03）显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，利舒
          行 ECL 化学发光显影。使用荧光图像分析系统分析各                          康低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠肺组织中 α-SMA
          条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度                       表达均显著降低（1.48±0.03、1.30±0.01、1.19±0.02、


          · 1990 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16                            中国药房  2025年第36卷第16期
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