Page 37 - 《中国药房》2025年16期
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carrier family 7 member 5，Slc7a5）抗体（批号GB114871-    2.3 子鼠存活数量、体重、体长及糖耐量检测
          100）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；辣根过氧化物                             各组孕鼠分娩产子后记录子鼠数量，子鼠由母鼠喂
          酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（货号 074-1506）购自美国                   养。于子鼠出生后第21天，统计其存活数量，并禁食不
          Kirkegaard & Perry Laboratories公司；RNA提取试剂盒、        禁水14 h，记录体重和体长；然后，各组取12只子鼠采用
          逆转录试剂盒（货号分别为 9109、RR037A）均购自宝生                     口 服 葡 萄 糖 耐 量 试 验（oral  glucose  tolerance  test，
          物工程（大连）有限公司；实时荧光定量 PCR 试剂盒（货                       OGTT），向各组孕鼠所产子鼠灌胃 20% 葡萄糖溶液，分
          号11201ES08）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。                     别于灌胃前和灌胃后30、60、120 min通过鼠尾采血检测
          1.3 实验动物                                           血糖水平，并计算曲线下面积（area under the curve，
                                                             AUC）。AUC＝（灌胃前血糖值+2×30 min 血糖值+3×
              选取 SPF 级健康生育期 SD 大鼠，雌性 90 只，雄性
          45 只，体重 220～260 g，由北京维通利华实验动物技术                    60 min血糖值+2×120 min血糖值）/4。
                                                             2.4 样本取材与处理
          有限公司湖北分公司提供，实验动物生产许可证号为
                                                                 根据OGTT结果（糖耐量受损）和随机数字表法，取
          SCXK（鄂）2022-0030。大鼠饲养于山西中医药大学屏
                                                             每组孕鼠所产子鼠 12 只，于出生后第 22 天禁食不禁水
          障环境动物实验室，室内温度（24±2）℃，相对湿度
                                                             8 h，尾部采血用于检测FBG；眼眶取血，室温静置2 h后
          40%～60%，12 h 光照/12 h 黑暗，通风良好，动物自由摄
                                                             分离上清液，冻存于－80 ℃冰箱中，用于检测胰岛素相
          食、饮水。动物实验经山西中医药大学医学伦理和学术
                                                             关指标。子鼠采血后断颈处死，于冰面上剖开腹部取胰
          委员会批准（批件号为2022DW125）。
                                                             腺，一部分浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织形
          2 方法
                                                             态观察；另一部分冻存于－80 ℃冰箱中，用于TMT蛋白
          2.1 左归丸药液的制备
                                                             质组学分析和Western blot、荧光定量PCR检测。
              分别取熟地黄 24 g、山药 12 g、枸杞子 12 g、山茱萸               2.5 子鼠FBG及胰岛素相关指标检测
          12 g、川牛膝 9 g、菟丝子 12 g、鹿角胶 12 g、龟甲胶 12 g，               取“2.4”项下子鼠的尾部血，使用血糖仪检测 FBG。
          除鹿角胶、龟甲胶外，其余药材加10倍量水，大火煮沸后                         取“2.4”项下子鼠眼眶血的血清上清液，采用 ELISA 法
          小火熬煮 30 min，分离药液；在药渣中再加入 8 倍量水，                    检测空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）水平，并计算胰
          按上述方法重复煎煮，再次分离药液；将两次分离的药                           岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）和稳态模型
          液混合，蒸发浓缩后，将鹿角胶、龟甲胶粉碎，分次缓慢                          评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of
          烊化后加入药液中，分别制得低、中、高质量浓度（0.472 5、                                                             1
                                                             insulin  resistance，HOMA-IR）。 ISI＝ln           ，
          0.945、1.89 g/mL，以生药量计）的左归丸药液，室温冷却                                                       FBG ´ FINS
                                                             HOMA-IR＝（FBG×FINS）/22.5。
          后置于4 ℃冰箱保存备用。
                                                             2.6 子鼠胰腺组织形态观察
          2.2 分组、造模与给药
                                                                 将“2.4”项下固定的胰腺组织用石蜡包埋、病理切片
              大鼠适应性饲养 7 d 后，以血糖值＜6.1 mmol/L 作
                                                             后进行HE染色，在显微镜下观察其病理学变化并拍照。
          为纳入标准。合格大鼠按雌、雄比例2∶1合笼过夜，次日
                                                             2.7 子鼠胰腺组织的TMT蛋白质组学分析
          早晨，雌鼠用阴栓或阴道涂片镜检见精子者定为受孕，
                                                                 采用 TMT 蛋白质组学分析胰腺组织的蛋白表达
          记为妊娠0.5 d。按随机数字表法选取6只为空白组，其
                                                             谱。分别从空白组、模型组、阳性对照组、左归丸中剂量
          余孕鼠于妊娠 3 d 禁食 12 h 后腹腔注射链脲佐菌素（33
                                                             组（根据后文结果确定为最优剂量组，下文同）中随机选
          mg/kg），构建GDM模型；妊娠6 d检测血糖，根据《中国2
                                                             择5只子鼠的胰腺组织，提取组织蛋白并用BCA法测定
          型糖尿病防治指南（2020 版）》，若空腹血糖（fasting
                                                             蛋白浓度后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
          blood  glucose，FBG）≥7  mmol/L 或 随 机 血 糖 ≥11.1
                                                             泳分析并对质量达标的蛋白样品进行还原烷基化处理。
          mmol/L，视为 GDM 造模成功。将造模成功的孕鼠随机                      每个样品取等量蛋白进行胰蛋白酶酶解，酶解后的肽段
          分为模型组、阳性对照组和左归丸低、中、高剂量组，每                          用 TMT 试剂标记并进行等量混合，通过 C18反相柱对混
          组 6 只。妊娠 6～18 d 期间，空白组、模型组孕鼠灌胃蒸                    合后的肽段进行预分离（紫外检测波长214 nm，流速200
          馏水，阳性对照组孕鼠根据血糖水平注射甘精胰岛素，                           μL/min，梯度洗脱48 min），随后进行液相色谱-串联质谱
          初始剂量2 U/只，次日以1 U为单位逐渐增加药量，直至                       分析。质谱扫描范围 m/z 350～1 500，采用数据依赖性
          孕鼠血糖恢复正常（平均每只孕鼠给药量为 20 U/kg）；                      采集模式，循环时间2 s，一级质谱分辨率60 000（最大注
          左归丸低、中、高剂量组孕鼠分别灌胃低、中、高质量浓                          入时间 25 ms），以高能碰撞解离为碎裂方式，二级分辨
          度的左归丸药液，给药剂量分别为4.725、9.45、18.9 g/kg                率15 000（最大注入时间22 ms），固定起始质量m/z 110。
         （中剂量为临床等效剂量换算而得），每日给药1次。                            质谱数据采用 Proteome Discoverer 软件进行解析，筛选


          中国药房  2025年第36卷第16期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16    · 1983 ·
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