Page 44 - 《中国药房》2025年15期

2.7 海马组织中 HSP90/MLKL/Drp1 信号通路相关蛋 2.9 血清中炎症因子水平检测
白表达的检测 取“2.4”项下血清样品，室温融化，按照 ELISA 试剂
采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻 盒说明书操作，采用酶标仪检测血清中IL-1β、IL-4水平。
存的大脑海马组织，经低温匀浆后，采用RIPA裂解液提 2.10 统计学方法

取蛋白，离心，取上清液，用 BCA 法测定蛋白浓度并进 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。满足正
行加热变性处理。取变性蛋白10 μg进行十二烷基硫酸 态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移到 PVDF 膜上，并 析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准
在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h；加入相应一抗[稀 α＝0.05。
释比例依次为抗GAPDH 1∶7 000，抗HSP90 1∶1 000、抗 3 结果
p-MLKL 1∶1 000，抗 MLKL 1∶500，抗 p-Drp1（Ser637） 3.1 益肺宣肺降浊方对VaD大鼠学习及空间记忆能力
1∶500，抗 p-Drp1（Ser616）1∶500，抗 Drp1 1∶2 000，抗 的影响
ATP5A 1∶5 000，抗 MFN1 1∶4 000，抗 MFN2 1∶6 000]， 与 SHAM 组比较，MOD 组大鼠逃避潜伏期显著延
于4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例均为1∶7 000）， 长，穿越平台次数显著减少（P＜0.05）；与MOD组比较，
室温孵育 2 h；经 TBST 缓冲液洗涤后，采用化学发光法 各给药组大鼠逃避潜伏期均显著缩短，穿越平台次数均
显影后进行蛋白条带成像，并通过 Image J 软件对条带 显著增加（P＜0.05）。结果见表2。
灰度值进行定量分析。以HSP90、ATP5A、MFN1、MFN2 表2 各组大鼠逃潜伏期及穿越平台次数比较（x±s，
n＝9）
与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目标蛋白
组别 逃避潜伏期/s 穿越平台次数/次
的表达水平，以 p-MLKL 与 MLKL、p-Drp1（Ser637）与
SHAM组 13.53±3.98 6.11±1.53
Drp1、p-Drp1（Ser616）与 Drp1 条带灰度值的比值表示 MOD组 45.76±5.78 a 1.66±1.22 a
MLKL、Drp1（Ser637）、Drp1（Ser616）蛋 白 的 磷 酸 化 YFXF-L组 36.38±4.50 b 3.44±0.88 b
YFXF-H组 26.52±2.76 b 4.77±1.09 b
水平。 DH组 24.25±1.84 b 5.00±1.00 b
2.8 海马组织中HSP90、MFN1、MFN2、ATP5A mRNA a：与SHAM组比较，P＜0.05；b：与MOD组比较，P＜0.05。
表达的检测 3.2 益肺宣肺降浊方对VaD大鼠海马CA1区组织病理
采用 qPCR 法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻存的 学变化的影响
海马组织适量，以Trizol通用试剂裂解，以异丙醇沉淀氯 SHAM组大鼠海马结构整齐，CA1区锥体细胞层排
仿，加入 75% 乙醇纯化得到总 RNA，分析纯度与浓度 列规整，细胞核形态正常。与SHAM组比较，MOD组大
后，将总RNA逆转录合成cDNA并进行PCR扩增。PCR 鼠海马组织损伤明显，CA1 区锥体细胞结构排列紊乱，
体系包括：cDNA 模板 1 μL，SYBR Green Master Mix 5 细胞大量坏死，染色不均，细胞间隙较大；大量神经元凋
μL，正、反向引物各 0.4 μL，加无核酸酶水至 20 μL。 亡、固缩、深染。与 MOD 组比较，各给药组大鼠海马组
PCR 扩增条件如下：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s， 织损伤均有改善，且呈现一定的量效关系，其中YFXF-L
60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参， 组大鼠海马 CA1 区组织损伤程度较 MOD 组有所改善，
采用 2 －ΔΔCt 法计算目标基因 mRNA 的相对表达量，结果 表现为细胞间隙缩小，但仍可见大量神经元固缩、深染，
以 SHAM 组为参照进行归一化处理。PCR 引物序列及 部分锥体细胞排列相对整齐，细胞核形态正常，染色均
产物长度见表1。 匀；YFXF-H 组和 DH 组大鼠海马组织损伤明显减轻，
表1 PCR引物序列及产物长度 CA1 区锥体细胞排列较为整齐，细胞核形态完整，仅见
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp 少量神经元固缩、深染，且两组改善效果相当。结果
GAPDH 正向：GACATGCCGCCTGGAGAAAC 138 见图1。
反向：AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
HSP90 正向：CAATTCATCGACGCTCTGG 109 3.3 益肺宣肺降浊方对VaD大鼠海马组织中p-MLKL
反向：TCCACAATGGTCAGGGTTCG 阳性表达量的影响
MFN1 正向：GTGGAGATACAGGCTACAGAAC 116 与 SHAM 组 比 较 ，MOD 组 大 鼠 海 马 组 织 中 p-
反向：ACAGCATTGCGTTGATGACAGA
MFN2 正向：CACCGTCAAGAAGGATAAGCG 103 MLKL 的阳性表达量显著升高（P＜0.05）；与 MOD 组比
反向：CAGTTCTGTATTCTGTGGTGTC
ATP5A 正向：GCTATTGGTCAGAAACGGTCC 97 较，各给药组大鼠海马组织中p-MLKL的阳性表达量均
反向：CAGCCTGCTTGGATAAGTCGT 显著降低（P＜0.05）。结果见图2、表3。

· 1862 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 15 中国药房 2025年第36卷第15期