Page 43 - 《中国药房》2025年15期
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素 1β（interleukin-1β，IL-1β）（货号 MM-0047R1）和 IL-4     血管分离操作。造模后第 3 天，进行 Morris 水迷宫行为
         （货号 MM-0191R1）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒                    学测评，以 SHAM 组大鼠逃避潜伏期为参考值，计算两
          均购自江苏酶免实业有限公司；HSP90 抗体（货号#                         组大鼠逃避潜伏期的差值与参考值之比，若该比值＞
          4877，兔 抗）购 自 美 国 CST 公 司 ；MLKL 抗 体（批 号             20%，则评定 VaD 模型构建成功 。将造模成功的大鼠
                                                                                         [14]
          A21894，兔抗）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；磷                       随机分为模型组（MOD 组）、益肺宣肺降浊方低剂量组
          酸化（phosphorylated，p）-MLKL 抗体（货号 ET1705-51，         [YFXF-L组，给药剂量为12.18 g/（kg·d）]、益肺宣肺降浊
          兔抗）购自杭州华安生物技术有限公司；Drp1抗体（货号                        方高剂量组[YFXF-H组，给药剂量为24.36 g/（kg·d）]、盐
          12957-1-AP，兔抗）、ATP 合成酶 5A（ATP synthase 5A，         酸多奈哌齐组[DH 组，给药剂量为 0.2 g/（kg·d），阳性对
          ATP5A）抗体（货号 66037-1-lg，兔抗）、线粒体融合蛋白                 照]，每组 9 只。药物持续干预 30 d，其中 MOD 组和
         （mitochondrial fusion protein，MFN）1 抗体（货号 66776-
                                                             SHAM组大鼠给予等体积生理盐水[10 mL/（kg·d）]。给
          1-Ig，鼠 抗）、MFN2 抗 体（货 号 67487-1-Ig，鼠 抗）、
                                                             药剂量依据60 kg成人的临床等效剂量换算确定。
          GAPDH抗体（货号60004-1-Ig，鼠抗）以及辣根过氧化物
                                                             2.3 Morris水迷宫实验
          酶标记的山羊抗兔二抗（货号SA00001-2）和山羊抗鼠二
                                                                 药物干预结束后，运用Morris水迷宫实验评估所有
          抗（货号 SA00001-1）均购自武汉三鹰生物技术有限公
                                                             大鼠的学习及空间记忆能力。每只大鼠连续进行 5 d
          司；p-Drp1 抗体（磷酸化位点 Ser637，货号 BD-PP0841，
                                                             Morris 水迷宫实验。将水迷宫划分为 4 个象限，平台置
          兔 抗）、p-Drp1 抗 体（磷 酸 化 位 点 Ser616，货 号 BD-
                                                             于第 2 象限，注水没过平台约 3 cm。前 4 d 进行定位航
          PP1318，兔抗）均购自苏州博奥龙科技有限公司；qPCR
                                                             行实验，分别将大鼠从4个象限放入，大鼠找到平台则停
          试剂盒（货号 Q712）、RNA 提取试剂（货号 R701-01）、逆
                                                             止实验，记录大鼠的逃避潜伏期；若大鼠 60 s 内未找到
          转录试剂盒（货号R123-01）均购自南京诺唯赞生物科技
                                                             平台，则引导它们至平台并停留1 min后取出。实验第5
          股份有限公司。实验所需 PCR 引物均由南宁捷尼斯生
                                                             天实施空间探索测试，采集第5天的实验数据，移除平台
          物科技有限公司完成设计与合成。
                                                             后记录各组大鼠60 s内穿越平台次数。
          1.3 实验动物
                                                             2.4 标本制备
              SPF级SD雄性大鼠45只，7周龄，体重（280±20）g，
                                                                 Morris水迷宫实验测试完成后，大鼠经20%乌拉坦
          由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供[生产许可证
          号为SCXK（湘）2019-0004]。所有大鼠均饲养于广西中                    麻醉后，腹主动脉取血，以3 000 r/min离心15 min，取上
          医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中（使用许可证                          清液，于－80 ℃储存，备用。取血后处死大鼠。随机选
          号为SYXK桂2024-0004），在恒温（24±1）℃、12 h光/暗               取各组 6 只大鼠，分离其大脑海马组织，置于－80 ℃超
          循环条件下饲养。实验方案经广西中医药大学动物实                            低温冰箱中保存，用于Western blot及qPCR检测。另取
          验伦理委员会审批通过（伦理批号 DW20220212-062-                    各组3只大鼠，经心脏灌注固定后取海马组织，用4%多
          08），所有操作均严格遵循实验动物福利伦理规范。                           聚甲醛固定，石蜡包埋，保存于 4 ℃，用于苏木精-伊红
          2 方法                                              （HE）染色及免疫组化分析。

          2.1 药液的制备                                          2.5 大脑海马CA1区组织病理学观察
              中药药液：称取黄芪、人参、麦冬、三七、苏子、石菖                           采用HE染色。取“2.4”项下制备的石蜡组织块，切
          蒲各15 g，桔梗、苦杏仁各10 g，酒大黄6 g，置于烧瓶中，                   片（5 μm），切片于苏木精-伊红染液染 3 min，用自来水
          加水 2 000 mL，煎煮 2 h×3 次；过滤，合并 3 次滤液，于               洗涤，分化液分化10 s，再用自来水洗涤。经无水乙醇水
          45 ℃水浴中减压浓缩至 1.218 g/mL（以生药量计），于                   化、二甲苯脱蜡、中性树胶封片后，于光学显微镜下观察
          4 ℃下保存备用。阳性对照溶液：取盐酸多奈哌齐片，研                         并采集大脑海马CA1区组织病理学图像。
          磨，溶于110 mL蒸馏水中，制成质量浓度为0.045 mg/mL                  2.6 海马组织中p-MLKL表达检测
          的阳性对照溶液。                                               采用免疫组化法检测。取“2.5”项下大鼠脑组织切
          2.2 造模、分组与给药                                       片，经烘干、二甲苯脱蜡、乙醇洗脱、抗原修复、封闭后，
              采用双侧颈总动脉结扎法建立 VaD 大鼠模型。将                       加入p-MLKL一抗（稀释比例为1∶50）及对应二抗孵育。
          大鼠随机分为假手术组（SHAM组，n＝9）和手术组（n＝                       显影阶段采用 DAB 显色试剂避光反应，苏木精复染细
          36）。手术组大鼠经异氟烷麻醉后，行颈部正中切口，分                         胞核，经氨水返蓝处理后用中性树胶封固，最后通过数字
          离并结扎双侧颈总动脉进行造模；SHAM组大鼠仅进行                          病理扫描系统采集图像，观察DAB显色强度并定量分析。


          中国药房  2025年第36卷第15期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 15    · 1861 ·
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