Page 51 - 《中国药房》2025年14期
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PBS 清洗 1 次，于流式管中加入 500 μL 1×Binding Buf‐           2.11 统计学方法
          fer 重悬细胞，每管加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 10 μL              使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。所有数
          PI，室温避光培养 10 min，使用流式细胞仪检测细胞凋                      据均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
          亡情况。                                               间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          2.7 M109细胞周期分布检测                                   3 结果
              将 M109 细胞按“2.5.2”项下方法分组、给药及联合                  3.1 给药后超声时间点的筛选结果
          超声辐照。24 h 后，消化并收集细胞，用 PBS 清洗 1 次，                      总体而言，给药后联合超声辐照能提高 NPs 对
          加入预冷的 70% 乙醇 1 mL，于 4 ℃固定过夜。次日离                    M109 细胞的增殖抑制率（P＜0.05）。与不超声组或给
          心，弃上清，加入预配的染色工作液（PI+RNaseA）500                     药后0 h超声组比较，给药后1、2 h超声组的细胞杀伤力
          μL并混匀，37 ℃避光培养30 min，使用流式细胞仪检测                     更强（P＜0.05）；但与给药后 1 h 超声组比较，给药后 2 h
          细胞周期分布。                                            超声组细胞增殖抑制率的提升不明显（P＞0.05）。因
          2.8 M109细胞内ROS水平检测                                 此，本研究确定后续体外细胞实验的超声时间点为给药
              将 M109 细胞按“2.5.2”项下方法分组、给药及联合                  后1 h。结果见表1。
          超声辐照。24 h 后，消化收集细胞，用 PBS 清洗 1 次，加                  表1 给药后不同时间点超声对 M109 细胞增殖抑制率
          入500 μL稀释的DCFH-DA染色液重悬细胞，培养箱内                           的影响（x±s，n＝5）
          培养 20 min（每隔 5 min 轻摇混匀 1 次，使探针和细胞充                 NPs质量浓度/（μg/mL）  不超声组  给药后0 h超声组  给药后1 h超声组  给药后2 h超声组
                                                              50          0.69±0.14  2.60±0.24 a  6.14±0.86 ab  6.04±1.70 ab
          分接触）。培养结束后，用 PBS 清洗 1 次，加入 500 μL                   100         2.39±0.48  5.04±0.82 a  8.93±1.78 ab  8.97±3.21 ab
          PBS 重悬细胞，然后转移至流式管中，使用流式细胞仪                          150         24.86±3.65  28.57±5.32  35.14±3.65 ab  34.51±3.04 ab
                                                              200         49.98±1.34  59.23±5.53 a  66.97±3.53 ab  67.84±6.45 ab
          检测细胞荧光强度。荧光强度越大表明细胞内 ROS 水
                                                              250         68.61±3.62  76.32±4.56 a  81.50±2.90 ab  81.78±3.97 ab
          平越高。                                                300         78.52±2.56  80.05±5.04 a  85.17±2.99 ab  84.79±2.46 ab
          2.9 M109细胞内MMP变化检测                                  350         81.74±1.96  82.32±2.86  86.96±4.01 ab  88.18±1.19 ab
                                                              400         85.00±2.49  85.83±2.93  91.27±3.05 ab  91.13±4.07 ab
              将 M109 细胞按“2.5.2”项下方法分组、给药及联合
                                                                a：与不超声组比较，P＜0.05；b：与给药后0 h超声组比较，P＜
          超声辐照。24 h 后，消化并收集细胞，用 PBS 清洗 1 次，                  0.05。
          加入 1 mL JC-10 染色工作液并混匀，于 37 ℃下培养 20                3.2 游离FA对M109、A549细胞的阻断结果
          min。离心，弃上清，用预冷的 JC-10 染色缓冲液洗涤细                         游离 FA 组 2 种细胞的增殖抑制率均在－3%～3%
          胞 2 次，加入 2 mL 完全培养基，用倒置荧光显微镜观察                     之间，说明在联合或不联合超声辐照的条件下，游离FA
          并拍照。使用Image J软件分析各组细胞的红/绿荧光比                       在 0～1 000 μg/mL 质量浓度范围内对 2 种细胞的生长
          值（红/绿荧光比值＝红色荧光强度/绿色荧光强度），比                         均无明显影响。游离 FA+NPs 组在不超声时，与同组的
          值越低表明细胞内MMP越低。                                     0 μg/mL 比较，随着游离 FA 质量浓度的增加（10 μg/mL
          2.10 小动物活体成像观察                                     质量浓度除外），NPs 对 M109 细胞的增殖抑制率下降
              调整 M109 细胞的密度为 5×10 个/mL，取 100 μL             （P＜0.05），而对 A549 细胞无明显影响（P＞0.05）；与不
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          细胞悬液，注射于小鼠右腋下，构建小鼠M109皮下瘤模                         超声比较，给药后1 h超声时，在各游离FA质量浓度下，
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          型。待肿瘤体积长至（200±20） mm 时，选取体重及肿                      2 种细胞的增殖抑制率均显著升高（P＜0.01）。结果
          瘤体积无显著差异的小鼠随机分为不超声组、给药后 0                          见表2。
          h超声组（给药后立即超声）和给药后1 h超声组，每组5                        表2 游离FA对M109、A549细胞增殖抑制的影响（x±
          只。每只小鼠尾静脉注射 0.2 mL NPs（DiR 质量浓度为                        s，n＝5）
          0.5 mg/mL），超声组给药后使用超声探头对肿瘤部位超                       组别      FA质量浓度/  M109细胞增殖抑制率/%   A549细胞增殖抑制率/%
          声 20 min。分别于给药前和给药后 0.5、1、1.5、2、4、8、                        （μg/mL）  不超声   给药后1 h超声  不超声   给药后1 h超声
                                                              游离FA组      0     1.44±0.41  1.63±0.72  2.35±0.88  －2.42±0.18
          24、48、72、96、120 h 进行活体荧光拍摄，观察各组小鼠                              10   －2.86±0.84  2.12±0.84  1.58±0.28  2.03±0.53
          的体内荧光分布情况。使用Living Image软件对图像进                                100    1.24±0.40  －2.10±0.75  －2.45±0.34  －2.58±0.82
                                                                        1 000  －2.82±0.90  1.24±0.49  2.31±0.44  1.35±0.43
          行处理，量化荧光强度。根据肿瘤靶向指数（tumor-                          游离FA+NPs组  0    55.72±4.83  66.75±4.04 a  13.02±3.51  21.08±4.78 a
          targeting index，TTI）以及梯形法计算的TTI-时间曲线下                          10   54.81±5.96  66.61±3.73 a  13.56±2.21  19.13±4.31 a
                                                                        100   49.47±4.28 b  60.90±3.47 ab  12.64±3.11  19.29±2.87 a
          面积（area under the TTI-time curve，AUTC）来评价 NPs
                                                                        1 000  30.34±5.80 b  47.54±3.82 ab  12.21±3.55  20.61±2.38 a
                                  [11]
          在小鼠体内的肿瘤靶向能力 。TTI（%）＝肿瘤区域荧
                                                                a：与同组不超声时比较，P＜0.01；b：与游离FA+NPs组的0 μg/mL
          光强度/全身荧光强度×100%。                                   比较，P＜0.05。

          中国药房  2025年第36卷第14期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14    · 1733 ·
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