Page 50 - 《中国药房》2025年14期
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1.4 实验动物                                            μg/mL），室温避光染色10 min，再用PBS清洗3次，最后
              SPF 级 BALB/c 小鼠 15 只，4 周龄，雄性，体重 14～             用倒置荧光显微镜观察细胞对NPs的摄取情况（细胞膜
          16 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可                         被DiR染色，呈红色；细胞核被DAPI染色，呈蓝色）。
          证号：SCXK（湘）2021-0002。小鼠饲养于云南中医药大                     2.4.2 NPs摄取率检测
          学实验动物中心，饲养于温度为22～25 ℃、相对湿度为                             分别将 M109 和 A549 细胞以每孔 1×10 个接种于
                                                                                                    4
          50%～70%、12 h 光照与 12 h 黑暗交替的环境中。本研                   黑色96孔板中，常规培养48 h，分为空白组（不含细胞）、
          究方案经云南中医药大学动物实验伦理审查委员会批                             对照组（空白培养基）、不超声实验组和超声实验组，每
          准（批准号：R-062024008）。                                 组设置 5 个复孔。除对照组外，其余各组每孔加入 100
          2 方法                                                μL含空白NPs的完全培养基。给药后继续培养3、6、12
          2.1 细胞培养                                            h，用 PBS 清洗 3 次，用多功能酶标仪（激发波长为 750
              将M109和A549细胞接种于含10%胎牛血清和1%                      nm，发射波长为 782 nm）测定各孔荧光强度，计算细胞
          双抗的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2的恒温                       对NPs的摄取率：摄取率（%）＝（实验组荧光强度－对照
          培养箱中培养。当细胞汇合率达80%～90%时传代，使                          组荧光强度）/空白组荧光强度×100%。
          用处于对数生长期的细胞进行实验。                                    2.5 M109细胞迁移和侵袭能力检测
          2.2 给药后超声时间点的筛选                                     2.5.1 细胞迁移能力检测
                                     4
              将 M109 细胞以每孔 1×10 个接种于 96 孔板中，常
                                                                  采用细胞划痕实验进行检测。将M109细胞以每孔
          规培养 24 h，设置不超声组和给药后 0、1、2 h 超声组。                         6
                                                              1×10 个接种于底部用黑色马克笔画有 3 条平行线的 6
          每组分别加入不同质量浓度的 NPs（50、100、150、200、
                                                              孔板中，培养 24 h，使用 200 μL 枪头垂直在孔板中划竖
          250、300、350、400 μg/mL，以 Cre 计；根据预实验及文献
                                                              痕，使之与黑色标记线相交并垂直，用PBS清洗1次，除
          [10]确定质量浓度），每个质量浓度设置 5 个复孔；同时
                                                              去划下的细胞团块。随后更换培养基为含2%胎牛血清
          设置对照孔和空白孔。除不超声组外，其余3组均在对
                                                              的 DMEM 培养基，设置对照组（空白培养基）和 NPs 低、
          应时间点联合超声辐照（超声探头垂直于孔板底面，每
                                                              中、高浓度（100、200、300 μg/mL，根据预实验结果确定
          孔超声 2 min，下同）。培养 24 h 后，用 PBS 清洗 1 次，每
                                                              质量浓度）组，每组设置3个复孔。给药并联合超声辐照
          孔加入新配的含10%CCK-8试剂的完全培养基100 μL，
                                                              后，使用倒置显微镜拍照记录同一划痕在 0、24 h 的变
          放入培养箱中培养 2 h，用酶标仪在 450 nm 波长处检测
                                                              化。使用 Image J 软件测量划痕宽度，并计算细胞划痕
          吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率
                                                              愈合率：细胞划痕愈合率（%）＝（0 h 划痕宽度－24 h 划
         （%）＝（A 对照－A 实验 ）/（A 对照－A 空白 ）×100%。
                                                              痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。
          2.3 游离FA对M109、A549细胞的阻断实验
                                                              2.5.2 细胞侵袭能力检测
              称取 FA 粉末 10 mg，加入 1 mL 磷酸氢二钠水溶液
                                                                  采用 Transwell 小室实验进行检测。将 Matrigel 基
         （pH 9.0）充分溶解，用DMEM完全培养基分别稀释至0、
                                                              质胶与无血清培养基按 1∶8 的体积比混匀，取 60 μL 滴
          10、100、1 000 μg/mL，再用磷酸二氢钠水溶液调节至
                                                              加到Transwell小室上室铺匀，将小室放入24孔板内，将
          pH＝7 后备用。分别将 M109 和 A549 细胞以每孔 1×
                                                              培养板在培养箱中放置 3 h 成膜。将 M109 细胞以每孔
          10 个接种于 96 孔板中，常规培养 24 h，设置游离 FA 组
            4
                                                                   5
          和游离 FA+NPs（NPs 质量浓度为 200 μg/mL，以 Cre 计）             5×10 个接种于 6 孔板中，培养 24 h，设置对照组（空白
          组，两组的FA质量浓度均为0、10、100、1 000 μg/mL（根                 培养基）和 NPs 低、中、高浓度（100、200、300 μg/mL，根
          据预实验结果确定质量浓度），每组设置5个复孔。两组                           据预实验结果确定质量浓度）组，每组设置3个复孔。给
          细胞分别进行给药后不超声和给药后联合超声辐照处                             药并联合超声辐照，培养24 h后，离心收集细胞，用PBS
          置（按“2.2”项下筛选的超声时间点进行超声辐照，下                          清洗1次，用无血清培养基重悬细胞并调整细胞密度为
                                                                   5
          同），放入培养箱中继续培养24 h，按“2.2”项下方法计算                      1×10 个/mL；取200 μL细胞悬液接种到Transwell小室
          细胞增殖抑制率。                                            上室，下室加入500 μL完全培养基，置于培养箱中培养
          2.4 M109、A549细胞对NPs的体外摄取实验                          48 h。使用棉签抹掉未侵袭的细胞，以 4% 多聚甲醛溶
          2.4.1 倒置荧光显微镜观察                                     液固定 20 min，0.1% 结晶紫染液染色 10 min，用 PBS 清
                                                5
              分别将M109和A549细胞以每孔5×10 个接种于6                     洗后，用倒置荧光显微镜观察细胞侵袭情况并计数。细
          孔板中，常规培养 24 h，加入 2 mL 含空白 NPs 的完全培                  胞侵袭数量越多说明侵袭能力越强。
          养基（DiR质量浓度为25 μg/mL），分为不超声组和超声                      2.6 M109细胞凋亡检测
          组，每组设置3个复孔。继续培养3、6、12 h后，用PBS清                          将 M109 细胞按“2.5.2”项下方法分组、给药及联合
          洗 3 次，加入 400 μL 即用型 DAPI 染色液（质量浓度为 2                超声辐照。24 h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，用


          · 1732 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14                            中国药房  2025年第36卷第14期
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