Page 43 - 《中国药房》2025年14期
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作为内参，采用 2     －ΔΔCt 法计算各目标基因 mRNA 的相对              3.1.2 参芪固本方抗CRF的核心活性成分预测
          表达量，结果以对照组为参照进行归一化处理。引物序                              “药物-成分-靶点”网络中包括节点289个、边1 499
          列及产物长度见表1。                                         条；通过分析 degree 值，筛选出排前 5 位的核心活性成
                      表1 引物序列及产物长度                           分，分别为槲皮素、山柰酚、木犀草素、常春藤皂苷元、
          基因           引物序列（5′→3′）               产物长度/bp     7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇。
          IL-17 RA     正向：GCTTCACCCTGTGGAACGAAT      98
                       反向：TATGTGGTGCATGTGCTCAAA              3.1.3 核心靶点及PPI网络
          IL-6         正向：ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG  149           PPI 网络中包括节点 109 个、边 2 542 条，获得 10 个
                       反向：CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG
          TNF-α        正向：CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG   220       核 心 靶 点 ，分 别 为 肿 瘤 蛋 白 p53（tumor  protein  p53，
                       反向：GAGGACCTGGGAGTAGATGAG              TP53）、丝 氨 酸/苏 氨 酸 激 酶 1（AKT  serine/threonine
          GAPDH        正向：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT    197       kinase 1，AKT1）、IL-6、IL-1β、表皮生长因子受体、TNF、
                       反向：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
                                                             原癌因子Jun、CASP3、原癌因子MYC、Bcl-2。
          2.2.7 细胞中凋亡蛋白和IL-17信号通路关键蛋白表达
          检测                                                 3.1.4 生物功能富集分析
              采用 Western blot 法检测细胞凋亡核心调控蛋白                      GO 功能富集分析共得到 568 个条目（P＜0.01），其
         （Bax、Bcl-2、cleaved-CASP3）和IL-17信号通路关键调控             中生物学过程占411个条目，涉及信号转导、基因表达的
          蛋白（IL-17RA、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65、p-p65）的         正调控、凋亡过程的负调控等；细胞组分占57个条目，涉
                                        5
          表达。取对数生长期细胞以 2×10 个/孔接种于 6 孔板                      及细胞质、细胞核、等离子膜等；分子功能占100个条目，
          中，培养 24 h 后，按“2.2.3”项下方法分组、给药。培养                   涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质同分异构活性等。
          48 h 后，收集各组细胞，提取总蛋白，经含量测定、变性                           KEGG通路富集分析共得到151条通路（P＜0.01），
          处理后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离                           主要包括 IL-17 信号通路、TNF 信号通路、磷脂酰肌醇 3
          并转移至聚偏氟乙烯膜上，以5%脱脂牛奶于室温下封闭                          激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K/Akt）、细胞衰老、p53信
          1 h；洗膜后，加入相应一抗（IL-17RA、p38 MAPK、p65、               号通路等；其中，P值最小且富集分数最高的为IL-17信
          p-p65、Bax、Bcl-2、cleaved-CASP3的稀释度均为1∶1 000，        号通路，富集靶点数最多的为PI3K/Akt信号通路。
          p-p38 MAPK的稀释度为1∶800，β-actin、GAPDH的稀释                  网络药理学分析结果预测，参芪固本方通过抑制
          度均为1∶5 000），于4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入相应二                     IL-17 信号通路改善 CRF 相关肿瘤炎症微环境。基于
          抗（稀释度为1∶10 000），于室温下孵育1 h；经曝光、成像
                                                             KEGG 富集通路及 PPI 核心靶点（IL-6、TNF-α）的关联
          后，使用 Image J 软件进行分析，以目的蛋白与内参
                                                             性，本研究采用 IL-17 诱导 A549 细胞构建 CRF 细胞模
         （β-actin或GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的表达
                                                             型，通过 IL-17 信号通路及其调控的下游促炎因子模拟
          水平。
                                                             肿瘤炎症微环境。
          2.3 统计学分析
                                                             3.2 细胞实验验证结果
              所有实验独立重复 3 次。采用 SPSS 26.0 软件进行
                                                             3.2.1 IL-17 作用的最佳浓度、时间筛选与参芪固本方
          数据统计分析，采用 GraphPad Prism 10.0 软件绘图。满
                                                             干预剂量筛选
          足正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用方
                                                                 干预24、48 h后，与0 ng/mL IL-17比较，随干预浓度
          差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
                                                             升高，细胞活力逐渐增加（P＜0.05）；与 100 ng/mL IL-17
          α＝0.05。
          3 结果                                               干预 48 h 比较，200 ng/mL IL-17 时细胞活力显著降低
          3.1 网络药理学分析结果                                     （P＜0.05），因此选择 100 ng/mL IL-17 作用 48 h 为最佳
          3.1.1 参芪固本方抗CRF的活性成分及靶点                            实验条件（图 1）。图 2 结果显示，参芪固本方在 1.00～
              初步检索获得黄芪活性成分 17 个、党参活性成分                       1.50 mg/mL 范围时，A 值随浓度升高显著降低（P＜
          17 个、茯苓活性成分 6 个、白术活性成分 4 个、淫羊藿活                    0.05），且在 1.50 mg/mL 达到抑制峰值；当浓度升至 1.75
          性成分 23 个、女贞子活性成分 9 个、五味子活性成分 8                     mg/mL 时，A 值回升，抑制效应减弱。1.00 mg/mL 是首
          个，药物作用靶点共 238 个；得到 CRF 相关靶点 8 387、                 次出现抑制的浓度，反映药物起效浓度；1.50 mg/mL为抑
          529 个，去重后获得与 CRF 相关疾病靶点 8 792 个；将药                 制峰值浓度，反映药物最佳效能。因此选定1.00 mg/mL
          物作用靶点与CRF相关疾病靶点取交集，获得参芪固本                         （低质量浓度）和1.50 mg/mL（高质量浓度）作为后续实验
          方治疗CRF的交集靶点209个。                                   的干预浓度。


          中国药房  2025年第36卷第14期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14    · 1725 ·
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