Page 42 - 《中国药房》2025年14期
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用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、                             2.2.2 参芪固本方干预剂量筛选
          合成。                                                     采用 CCK-8 法检测。取对数生长期细胞以 5×10                3
          1.3 细胞                                              个/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h 后，将其分为 IL-17 干
              人 A549 肺癌细胞（批号 FH0045）购自上海富衡生                   预组[加入含有 100 ng/mL IL-17（按“2.2.1”项下结果设
          物科技有限公司。                                            置）、不含参芪固本方的完全培养基100 μL]和参芪固本
          2 方法                                                方组[分别加入含100 ng/mL IL-17及不同质量浓度参芪
          2.1 网络药理学分析                                         固本方（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mg/mL）的
          2.1.1 参芪固本方活性成分及CRF靶点获取                             完全培养基100 μL]。同时，设置不含细胞、不含药物的
              使用 TCMSP 数据库（https：//tcmsp-e.com/），以口服          空白组。每组设置 3 个复孔。培养 48 h（按“2.2.1”项下
          生物利用度≥30%、类药性≥0.18 为条件 ，筛选得到参                       结果设置）后，按“2.2.1”项下方法检测并计算细胞活力。
                                             [8]
          芪固本方的活性成分。通过TCMSP网站内置靶点预测                           2.2.3 细胞迁移能力检测
          功能获取活性成分对应靶点，将整理得到的靶点经                                  采用细胞划痕实验进行检测。取对数生长期细胞
                                                                     5
          UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）校准得到标准         以 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，使用无菌
          化的基因名，即为参芪固本方的药物成分靶点。以                              200 μL枪尖于单细胞层上垂直、均匀快速地划各孔细胞
         “cancer-related fatigue”为关键词检索 GeneCards 数据库         的培养皿底部，保持划痕宽度一致。之后将其分为对照
         （https：//www. genecards. org/）、OMIM 数 据 库（https：//   组、IL-17干预组和IL-17+参芪固本方低、高质量浓度组
          www.omim.org/），得到CRF的相关靶点，剔除重复靶点，                  （根据“2.2.2”项下结果，参芪固本方低、高质量浓度分别
          经 UniProt 数据库校正，得到疾病靶点。通过 R 4.3.2 软                 为 1.0、1.5 mg/mL），每组设置 3 个复孔。于 0、48 h 时观
          件对药物成分靶点与疾病靶点取交集，使用 Cytoscape                       察、拍照。使用 Image J 软件测量划痕宽度并计算细胞
          3.7.2软件构建“药物-成分-作用靶点”网络。                            迁移率：细胞迁移率（%）＝（0 h 初始面积－48 h 终点面
          2.1.2 蛋白-蛋白相互作用网络的构建                                积）/0 h初始面积×100%。
              将交集靶点导入 STRING 数据库（https：//string-db.           2.2.4 细胞凋亡检测
          org/），物种设置为“Homo sapiens”、最低相互作用阈值设                     采用流式细胞术检测。取对数生长期细胞以 2×
                                                                5
          置 0.7，构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interac‐          10 个/孔接种于6孔板中，培养24 h后，按“2.2.3”项下方
          tion，PPI）网络图。将 PPI 网络图导入 Cytoscape 3.7.2 软          法分组、给药。培养 48 h 后，收集各组经不含乙二胺四
          件进行拓扑学分析，包括度值（degree）和相互作用评分                        乙酸胰酶消化的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，以
         （combined score），并以degree＞9为标准筛选核心靶点。                300×g 离心 5 min。加入染色缓冲液 100 μL 重悬细胞，
          2.1.3 生物功能富集分析                                      加入Annexin Ⅴ-FITC染液和PI染色液各5 μL，于避光、
              将交集靶点导入 DAVID 数据库（https：//david.ncif‐           室温下反应 10 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡
          crf.gov/summary.jsp）进行基因本体（gene ontology，GO）        情况。
          功能、京都基因和基因组数据（Kyoto encyclopedia of                 2.2.5 细胞上清液中IL-6、TNF-α水平检测
          genes and genomes，KEGG）通路富集分析。P＜0.01 表                  采用 ELISA 法检测。取对数生长期细胞以 2×10                5
          示差异有统计学意义。                                          个/孔接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，按“2.2.3”项下方法
          2.2 细胞实验                                            分组、给药。培养48 h后，收集各组细胞的上清液，使用
          2.2.1 IL-17作用于A549细胞的最佳浓度、时间筛选                      酶标仪检测其IL-6、TNF-α水平。严格按照相应试剂盒
              采用 CCK-8 法检测。取 A549 细胞，接种于完全培                   说明书操作。
          养基，于37 ℃、5% CO2条件下培养。取对数生长期细胞                       2.2.6 细胞中IL-17 RA、IL-6、TNF-α mRNA表达检测
          以5×10 个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，将其分为                          采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取对数生长
                 3
          对照组[加入完全培养基（不含 IL-17）100 μL]和给药组                    期细胞以 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，按
                                                                           5
          [分别加入含不同质量浓度 IL-17（0、25、50、100、200                 “2.2.3”项下方法分组、给药。培养 48 h 后，收集各组细
          ng/mL）的完全培养基100 μL]。同时，设置不含细胞、不                     胞，使用Trizol法提取总RNA。经检测浓度、纯度后，反
          含药物的空白组。每组设置3个复孔。取各组细胞，分                            转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体
          别培养 24、48 h 后，于避光条件下加入 CCK-8 试剂 10                  系包括：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引
          μL；继续培养 2 h，使用酶标仪于 450 nm 波长处检测各                    物各 0.4 μL（10 μmol/L），模版 cDNA（100 ng/μL）2 μL，
          孔的吸光度（A）值，计算细胞活力：细胞活力＝（A 实验组－                       无核酸酶水 7.2 μL。扩增条件如下：95 ℃预变性 30 s；
          A 空白组 ）/（A 对照组－A 空白组 ）。                             95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共循环40次。以GAPDH


          · 1724 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14                            中国药房  2025年第36卷第14期
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