Page 37 - 《中国药房》2025年14期
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大学动物保护委员会关于实验动物操作与动物福利的                            2.7  肺 组 织 中 IL-6、IL-13、TNF- α、IFN- γ、TSLP、
          要求（伦理编号为SDUTCM20210917001）。                        TLR4 mRNA表达检测
          2 方法                                                   采用荧光定量 PCR 法进行检测。各组随机选取 3
          2.1 麻黄-桂枝药对冻干粉的制备                                  只大鼠的肺组织左上叶，用 Trizol 法提取 RNA，检测
              称取麻黄饮片18 g，加8倍量蒸馏水浸泡30 min，武                   RNA 的浓度与纯度后，反转录合成 cDNA。以 cDNA 为
          火煎煮微沸后用文火煎煮20 min；称取桂枝饮片18 g，加                     模 板 进 行 PCR 扩 增 。 PCR 体 系（15  μL）为 2×qPCR
          入至上述麻黄煎液中，武火煎煮沸后用文火煎煮 40                           Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L的正、反向引物共1.5 μL，cDNA
          min，煎煮液过滤获得滤液；药渣加蒸馏水文火煎煮 40                        模板2 μL，无核酶水4 μL。反应条件为95 ℃预变性30
          min后过滤获得滤液。合并2次滤液，减压浓缩，制成冻                         s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个循环。
          干粉，研磨后用密封袋保存于干燥器中，待用。                              PCR引物由武汉赛维尔生物科技有限公司提供，引物序
          2.2 分组、造模与给药                                       列与产物长度见表 1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyce-
              将大鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组                           raldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，
                                               [6]
          [1 mg/（kg·d），参考前期预实验和相关文献 设置]和麻                    采 用 2 －ΔΔCT  法 计 算 IL-6、IL-13、TNF- α、IFN- γ、TSLP、
          黄-桂枝低、中、高剂量组[0.234、0.936、1.872 g/（kg·d），           TLR4 mRNA的表达水平。
          以冻干粉的量计，低剂量为临床等效剂量]，每组 10 只。                                   表1 引物序列与产物长度
          模型组和各给药组大鼠分别于第1天和第8天腹腔注射                            基因名称        引物序列（5′→3′）                产物长度/bp
          1 mL 抗原液（每毫升含 OVA 100 mg、氢氧化铝 100 mg）               GAPDH       正向：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG    138
                                                                          反向：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
          致敏，空白组大鼠同期腹腔注射等体积生理盐水；除空                            IL-6        正向：AGACAGCCACTCACCTCTTCAG    131
          白组外，其余各组大鼠除第 1 天和第 8 天外施以“形寒、                                   反向：TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG
          饮冷”刺激，即将大鼠每日置于0 ℃冰箱内冷处理3 h以                         IL-13       正向：GCAACAGCAGCATGGTATGGAG    124
                                                                          反向：GCCATTCAATATCCTCTGGGTC
          及24 h冰水喂养，从第15天起，大鼠饮用冰水与冷处理刺
                                                              TNF-α       正向：CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA    80
          激后，用1%OVA雾化激发哮喘，每天1次，每次30 min，连                                 反向：GGTATGAAATGGCAAATCGGCT
          续雾化 8 d，空白组大鼠使用等体积生理盐水雾化。从                          IFN-γ       正向：GGAACTGGCAAAAGGACGGT      130
          第2天开始，各给药组大鼠灌胃相应药物，空白组和模型                                       反向：AGGTGCGATTCGATGACACTTA
                                                              TSLP        正向：GGTTCCAGGAGAAACAAAGTAGG   123
                                                       [7]
          组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续给药21 d 。                                    反向：AGTTGTAAGTTAGTGCCAGCCGT
          2.3 一般行为学观察                                         TLR4        正向：CCAGGTGTGAAATTGAGACAATTG  191
              观察各组大鼠实验过程中的精神状态、呼吸情况、                                      反向：AAGCTGTCCAATATGGAAACCC
          皮毛润泽情况、体重变化、饮食及饮水量变化，以及口鼻                          2.8 肺组织中TSLP、TLR4蛋白表达检测
          分泌物、咳喘、打喷嚏、挠鼻、呼吸急促、口唇变化等哮喘                             采用 Western blot 法进行检测。各组随机选取 3 只
          特异性症状体征的变化。                                        大鼠的肺组织右上叶，制成匀浆，冰浴静置30 min，加入
          2.4 肺功能指标检测                                        RIPA 裂解液 30 min 后，于 4 ℃以 12 000 r/min 离心 20
              采用动物无创肺功能检测系统分别测定各组随机                          min，提取蛋白上清，检测蛋白浓度，于沸水中变性 15
          选取的5只大鼠造模前（第1天）和末次给药后（第22天）                        min，放入－20 ℃冷冻，待用。取变性后的蛋白样品，电
          的呼气流量峰值（peak expiratory flow，PEF）、气道阻力             泳、分离、转膜、封闭后，加入 TSLP、TLR4、β-actin 抗体
         （airway  resistance，Raw）、功 能 残 气 量（functional  re‐  （稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育
          sidual capacity，FRC）、呼气中期流速（expiratory flow at     过夜；第2天加入二抗（稀释比例为1∶10 000），室温孵育
          50% of forced vital capacity，EF50%）。               2.5 h，用增强化学发光试剂显色、曝光，凝胶成像系统拍
          2.5 血清中IL-6、IL-13、TNF-α、IFN-γ含量检测                  摄。以β-actin为内参，用Image J软件进行分析，以目的
              各组大鼠在末次给药后，禁食不禁水 12 h，于其腹                      蛋白与内参的灰度值比值作为目的蛋白的表达水平。
          主动脉取血，静置2 h，以3 500 r/min离心15 min，取上清               2.9 统计学方法
          液。按照 ELISA 试剂盒说明书方法检测各组随机选取                            采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资
          的3只大鼠血清中的IL-6、IL-13、TNF-α、IFN-γ含量。                 料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步
          2.6 肺组织病理学形态观察                                     两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
              各组大鼠取血后处死，分离肺组织。随后，各组随                         3 结果
          机选取 3 只大鼠的肺组织左下叶，用 4% 多聚甲醛溶液                       3.1 大鼠一般行为学比较
          固定24 h；取部分组织，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后切                            与空白组比较，模型组大鼠从第 5 天开始出现抓耳
          片，然后进行苏木精-伊红（HE）染色，最后使用显微镜观                        挠腮、咳嗽、情绪躁动等表现，雾化激发期（第15～22天）
          察大鼠的肺泡、支气管形态变化以及炎症浸润情况。                            出现了体重减轻、进食量减少以及严重咳喘、扎堆蜷缩、


          中国药房  2025年第36卷第14期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14    · 1719 ·
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