Page 29 - 《中国药房》2025年14期
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1.3 实验动物                                           2.1.4 小鼠结肠组织病理形态观察和杯状细胞占比
              SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，6～8 周龄，体重 20～22             检测
          g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可                             取各组小鼠结肠组织适量（因经费原因，结合前述
          证为 SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均饲养于广西医                    实验结果，本研究仅从上述组别中随机选择3只小鼠的
          科大学药学院动物饲养中心[温度（25±2）℃，相对湿度                        结肠组织进行考察），以4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、
                                                             石蜡包埋后切片；切片经脱蜡、乙醇梯度脱水后，进行
          55%～65%，昼夜交替]，自由摄食、饮水。本实验方案已
                                                             HE 染色，使用显微镜观察小鼠结肠组织的病理学形态
          通过广西医科大学实验动物伦理委员会审批（编号
                                                             并进行病理学评分。该评分为炎症评分和组织损伤评
          202310012）。
                                                             分之和，具体标准为——（1）炎症评分：肠道黏膜固有层
          2 方法
                                                             无炎症细胞，记 0 分；肠道黏膜固有层炎症细胞数量增
          2.1 AG对UC小鼠的改善作用评价                                 加，记1分；炎症细胞延伸至黏膜下层，记1.5分；炎症细
          2.1.1 造模、分组与给药                                     胞跨壁浸润，记2分。（2）组织损伤评分：无黏膜损伤，记
              取小鼠40只，适应性喂养7 d后，随机分为正常对照                      0分；可见离散性上皮损伤，记1分；可见表面黏膜糜烂，
          组（CON组）、模型组（DSS组）、阳性对照组（5-ASA组）、                   记1.5分；存在广泛的黏膜损伤并延伸至肠壁深部结构，
                                                                   [8]
          紫云英苷低剂量组（AGL 组）和高剂量组（AGH 组），每                      记2分 。取各组小鼠结肠组织切片，同法处理后，进行
          组 8 只。在实验的第 1～7 天，除 CON 组小鼠自由饮水                    AB-PAS，使用显微镜观察并采用 Image J 软件评估各组
          外，其余各组小鼠均饮用 3%DSS 溶液（若出现活动减                        小鼠结肠杯状细胞占比（杯状细胞被染为蓝色，以其染
                                                             色面积在总面积中的百分占比表示）的变化情况。
          少、立毛、体重下降、腹泻和便血等症状，则认为UC模型
                                                             2.1.5  小 鼠 结 肠 组 织 中 肠 道 屏 障 及 炎 症 相 关 因 子
                  [7]
          构建成功 ）；在实验的第 8～14 天，将 3%DSS 溶液换为
                                                             mRNA表达检测
          水，同时 5-ASA 组小鼠灌胃 100 mg/kg 的 5-ASA，AGL、
                                                                 采用实时定量 PCR 法检测。取 CON 组、DSS 组、
          AGH组小鼠分别灌胃50、100 mg/kg的AG，灌胃体积均
                                                             AGH组小鼠结肠组织适量（因经费原因，结合前述实验
          为0.02 mL/g，每天1次（以生理盐水为溶剂，药物剂量均
                                                             结果，本研究仅从上述组别中随机选择3只小鼠的结肠
          参考既往研究设置 ）；CON 组、DSS 组小鼠灌胃等体积
                          [5]
                                                             组织进行考察），严格按照试剂盒说明书方法提取其总
          生理盐水，每天1次。                                         RNA 并逆转录合成 cDNA。经浓度、纯度检测后，以此
          2.1.2 小鼠体重变化指数、活动性疾病指数、结肠长度、                       cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系共10 μL，
          脾脏指数检测                                             包括cDNA模板1 μL、2×SYBR Green定量PCR混合物
              实验期间，观察各组小鼠的体重变化情况，于末次                         5 μL、正向/反向引物（各引物系列及产物长度见表1）各
          给药后计算其体重变化指数[即末次给药后（第14天）与                         0.2 μL、无核酶水 3.6 μL。反应条件为 94 ℃预变性 30
          饮用 3%DSS 溶液首日（第 1 天）的体重之比]，并进行活                    s；94 ℃变性 5 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 45 个循环。以
          动性疾病指数（disease activity index，DAI）评价。DAI评          β-actin为内参，采用2    －ΔΔCt 法计算肠道屏障相关因子（oc‐
                                                             cludin、ZO-1）和炎症相关因子（p38 MAPK、JNK、SIRT1）
          分为体重变化、粪便稠度、粪便隐血度3项评分的平均值，
                                                             mRNA的相对表达量。
          具体标准为——（1）体重变化评分：体重减轻＜1%，记0
                                                                         表1 PCR引物及产物长度
          分；体重减轻1%～＜5%，记1分；体重减轻5%～＜10%，
                                                              目的基因         引物序列（5′→3′）              产物长度/bp
          记2分；体重减轻10%～＜15%，记3分；体重减轻≥15%，                      occludin     正向：CTCGGTACAGCAGCAATGGT    117
          记 4 分。（2）粪便稠度评分：粪便正常，记 0 分；便稀，记 2                                反向：TCATAGTGGTCAGGGTCCGT
                                                              ZO-1         正向：CAGAACCAAAGCCTGTGTATG   150
          分；明显腹泻，记4分。（3）粪便隐血度评分：粪便无隐血，
                                                                           反向：TTAGGTAGGACACCATCAGATGGA
                                                [8]
          记 0 分；隐血阳性，记 2 分；明显出血，记 4 分 。末次给                    p38 MAPK     正向：GCTCGGTGTGTGCTGCTTTT    104
          药2 h后，各组小鼠以颈椎脱臼法处死，分离其结肠并测                                       反向：CCTGTAGGTCCTTTTGGCGT
                                                              JNK          正向：TGTTTCCTGATGTGCTTTTCC   233
          量结肠长度，分离脾脏、称重并计算脾脏指数（脾脏指                                         反向：CTCCTCTATTGTGTGCTCCCT
          数＝脾重/体重×100%）。                                      SIRT1        正向：TAGACAGGCTGGAACAGGTTG   203
                                                                           反向：GGTTTGATGATAGCAAGCGG
          2.1.3 小鼠结肠组织中炎症因子检测
                                                              β-actin      正向：GGCTCCTAGCACCATGAAGA    187
              取各组小鼠结肠组织适量，加 9 倍量的磷酸盐缓冲                                     反向：AGCTCAGTAACAGTCCGCC
          液（PBS），匀浆，离心 20 min 后，收集上清液，参照相应                   2.1.6 小鼠肠道菌群检测
          试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测其中炎症因子                                 取 CON 组、DSS 组、AGH 组小鼠的粪便样品（考虑
         （TNF-α、IL-1β、IL-6）水平。                               到小鼠个体间肠道菌群及其代谢物差异度比一般生化


          中国药房  2025年第36卷第14期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14    · 1711 ·
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