Page 41 - 《中国药房》2025年10期
P. 41

手段有肺移植和药物治疗，虽然药物治疗能暂缓 IPF 进                        木素-伊红（HE）染色液、Masson 染色试剂盒（批号分别
                                                    [4]
          程，但对肺部炎症、持续性纤维化等均无显著作用 。                           为 G1120、G1340）购自北京索莱宝科技有限公司；免疫
              有研究表明，细胞衰老可能是 IPF 发生的重要因                       组化试剂盒（批号为PV-9000）购自北京中杉金桥生物技
            [5]
          素 。IPF患者肺组织中细胞周期抑制蛋白[如细胞周期                         术有限公司。
          蛋白依赖性激酶抑制剂 2A（cyclin-dependent kinase in‐          1.3 实验动物
          hibitor 2A，CDKN2A；简称为 P16）、CDKN1A（简称为                  本研究所用动物为 8 周龄 SPF 级 SD 大鼠，体重
          P21）]表达明显升高，且与 IPF 的病情严重程度呈正相                      200～220 g，共36只，雌雄各半，均购自长沙市天勤生物
            [6]
          关 ；此外，增多的衰老细胞可通过促进衰老相关分泌表                          技术有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（湘）2019-
          型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）等  0014。大鼠饲养于贵州中医药大学动物实验中心，环境
                                        [7]
          关键效应因子的释放加速 IPF 发展 。在细胞衰老这一                        温度（22±2） ℃、相对湿度（40±5）%，光照明暗 12 h 交
          过程中，转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，       替饲养。大鼠适应性喂养1周后进行实验，本实验经过
          TGF-β1 ）/Smad信号通路扮演了重要角色，抑制该信号通                    贵州中医药大学伦理委员会批准（编号为20220117）。
          路可延缓细胞衰老，从而缓解IPF 。                                 2 方法
                                      [8]
              中医认为IPF属“肺痹”“肺痿”疾病范畴。本课题组                      2.1 补阳还五汤药液制备
          前期研究发现，IPF发病的关键环节乃“肺损络伤”，以肺                            取黄芪120 g、当归6 g、赤芍4.5 g、地龙3 g、川芎3 g、
          气亏虚为本、痰瘀伏络为标。因此，临床常以益气活血                           红花 3 g、桃仁 3 g 混匀，加入 10 倍量水浸泡 1 h，煮沸后
          通络疗法为主要治法。补阳还五汤出自清代王清任《医                           以小火煎煮90 min，过滤；再加入10倍量水，煮沸后以小
          林改错》，是益气活血的代表方剂，具有补而不滞、活血                          火煎煮 1 h，过滤；合并 2 次滤液，浓缩，即得质量浓度为
          不伤正的特点。近年来，补阳还五汤被广泛用于 IPF 的                        1.287 g/mL的补阳还五汤药液（以生药量计）。
          治疗，且取得了较好疗效 。基于此，本研究通过建立                           2.2 分组、造模与给药
                                [9]
          IPF大鼠模型，从细胞衰老的角度，探究补阳还五汤治疗                             将 36 只大鼠随机分为正常组、模型组、吡非尼酮组
          IPF的作用机制，以期为临床治疗IPF提供理论基础。                        （阳性对照，0.162 g/kg，剂量根据临床等效剂量换算）和
          1 材料                                               补阳还五汤低、中、高剂量组（6.435、12.87、25.74 g/kg，其
          1.1 主要仪器                                           中中剂量为临床等效剂量），每组6只。除正常组外，其
              EG1150H 型包埋机、RM2265 型切片机购自德国                   余各组大鼠吸入异氟烷麻醉后，参照文献[10]方法构建
          Leica公司；H185OR型台式高速冷冻离心机购自湖南湘                      IPF模型：将大鼠以30°仰卧位固定，用18号套管针经声
          仪实验室仪器开发有限公司；BX35 型正置光学显微镜                         门插入气管，确认插管成功后，迅速经套管针注射硫酸
          购自日本 Olympus 公司；PowerPac Basic 型电泳仪、165-           博来霉素（5 mg/mL），然后快速将大鼠直立并沿纵轴旋
          8004型湿法转膜仪、ChemiDoc 型化学发光检测系统均                     转促进药物在其肺内分散；当大鼠出现喜静倦动、皮毛
                                   TM
          购自美国Bio-Rad公司。                                     微黄枯燥、口唇爪甲紫绀、摄食饮水量减少、弓背姿态
          1.2 主要药品与试剂                                        等，表明造模成功。造模成功第2天开始给药，各给药组
              黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、红花、桃仁饮片（批号                      大鼠灌胃相应药液，正常组大鼠灌胃等体积生理盐水，
          分 别 为 211101、210101、210301、220201、211001、          每天1次，连续28 d。
          211201、20211208）均购自贵阳市同仁堂大南门店，经贵                   2.3 取材及肺组织外观形态观察
          州中医药大学药学院中药鉴定教研室吴之坤教授鉴定                                末次给药后，各组大鼠吸入异氟烷麻醉后处死；取
          为真品。硫酸博来霉素（批号B802467，规格25 mg）、吡                    大鼠全肺，以生理盐水冲洗表面，滤纸吸干表面水分，称
          非尼酮（批号M823668，纯度98%）均购自上海麦克林生                      重并拍照（以观察大鼠肺组织结构、出血、瘀斑等病理改
          化科技有限公司；兔源TGF-β1、Smad同源物3（Smad3）、                  变）；然后将左肺置于 4% 多聚甲醛中固定，右肺置于
          Smad7、P16、P21、表皮生长因子（epidermal growth fac‐         －80 ℃条件下冻存，备检。
          tor，EGF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor          2.4 肺组织病理学形态观察
          receptor，EGFR）多克隆抗体（批号分别为 bs-0086R、bs-                 将各组大鼠固定的肺组织取出，修剪平整，经梯度
          3484r、bs-0566R、bs-0740R、bs-55160R、bs-2010R、bs-     乙醇脱水、浸蜡、包埋后，制成厚度为4 μm的切片；取部
          0165R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；鼠源基质                        分切片分别进行HE染色和Masson染色，然后置于光学
          金属蛋白酶 12（matrix metalloproteinase 12，MMP-12）单      显微镜下观察肺组织切片的病理学形态变化，并采用
          克隆抗体（批号 sc-390863）购自圣克鲁斯生物技术（上                     Image J软件计算胶原沉积分数（胶原沉积分数＝视野下
          海）有限公司；兔源趋化因子配体2（chemokine ligand 2，               胶原纤维面积/总面积×100%）。
          CCL2）、白细胞介素 4（interleukin-4，IL-4）多克隆抗体，            2.5 肺组织中P16、P21、TGF-β1、Smad3、Smad7、EGF、
          兔源 GAPDH 单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗                        EGFR蛋白表达检测
          兔二抗（批号分别为 66272-1-Lg、66142-1-Lg、60004-1-               采用免疫组化法进行检测。取“2.4”项下各组 3 只
          Lg、SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；苏                     大鼠切片，经脱蜡至水、抗原修复、阻断后，加入 P16、


          中国药房  2025年第36卷第10期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 10    · 1187 ·
   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46