Page 21 - 《中国药房》2024年24期
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分别取雌性和雄性斑马鱼1条，放在交配容器中，用隔板                          IL-1β）、Nrf2、酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员（acyl-
          隔开，待适应后取出隔板让其自然交配，并在交配后的                           CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）。
          第2天早上收集胚胎。本动物实验方案由黑龙江中医药                           2.1.3 中心靶点的富集分析
          大学实验动物伦理委员会批准（编号2021052701）。                           将“2.1.2”项下所得膈下逐瘀汤作用于MAFLD铁死
          2 方法与结果                                            亡的中心靶点导入 DAVID 数据库进行基因本体（gene
          2.1 网络药理学分析                                        ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto Ency‐
          2.1.1 膈下逐瘀汤活性成分及对应靶点的筛选                            clopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。其
              在TCMSP数据库中检索膈下逐瘀汤12味中药的化                       中，GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、
          学成分，以口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18为标                        细胞成分（cellular components，CC）和分子功能（molecu‐
                                  [9]
          准筛选该方的潜在活性成分 ；同时，以各组方药材名称                          lar function，MF），KEGG 富集以 P＜0.05 为标准筛选膈
                                                                                                     [10]
          为检索词，在中国知网中查询相关文献进行补充。将筛                           下逐瘀汤作用于MAFLD铁死亡所涉及的通路 。
          选得到的潜在活性成分导入PubChem数据库，查询各成                            GO 富集分析结果（图 1A）表明，中心靶点的 BP 主
          分的化学结构并保存为“smiles”格式；将上述格式文件                       要涉及 RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向/负向调控、基
          导入 Swiss Target Prediction 数据库，设置物种为“Homo          因表达的正向调控、细胞凋亡过程的正向调控、细胞对
                                           [9]
          sapiens”，以P＞0为阈值进行靶点预测 ，得到潜在活性                     缺氧的反应、对药物的反应等；CC 主要包括细胞核、细
          成分对应靶点；将膈下逐瘀汤的潜在活性成分及其对应                           胞溶质、细胞质、核原形质等；MF主要包括蛋白质结合、
          靶点录入 Cytoscape 软件，构建“药物-成分-靶点”网络，                  酶结合、RNA 聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性
          并利用该软件的“CytoNCA”插件计算网络中各节点的                        DNA 结合、DNA 结合等。KEGG 通路分析结果显示，
          度值（degree），获取排前10位的主要活性成分。                         lgP排序前20条通路（图1B）除铁死亡本身外，还涉及癌
              结果显示，共筛选得到潜在活性成分 277 个及对应                      症途径、结肠直肠癌、脂质和动脉粥样硬化、叉头框转录
          靶点1 030个，由所得膈下逐瘀汤“药物-成分-靶点”网络                      因子O信号通路、酒精性肝病、胰腺癌、志贺氏菌病等。
         （图略）可见，degree排前10位的主要活性成分依次为槲                       2.1.4 分子对接
          皮素、山柰酚、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、异鼠李素、罗                            本研究将膈下逐瘀汤的主要活性成分与该方作用
          痛定、木犀草素、黄芩素、柚皮素。                                   于 MAFLD 铁死亡过程的中心靶点进行分子对接，具体
          2.1.2 膈下逐瘀汤作用于 MAFLD 铁死亡的中心靶点                      过程如下：利用TCMSP数据库下载主要活性成分（槲皮
          筛选                                                 素、山柰酚、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、异鼠李素、罗痛
              利用GeneCards和OMIM数据库获得MAFLD相关                   定、木犀草素、黄芩素、柚皮素）的结构图，以“SDF”格式
          靶点；从 FerrDb 数据库中筛选铁死亡相关靶点。将                        保存；使用 OpenBabel GUL 软件将上述“SDF”格式文件
         “2.1.1”项下所得膈下逐瘀汤潜在活性成分对应靶点、                         转换为“PDB”格式，同时利用PDB数据库下载中心靶点
          MAFLD 相关靶点和铁死亡相关靶点取交集，并使用                         （TP53、JUN、HIF1A、STAT3、SIRT1、IL-1β、Nrf2、ACSL4）
          Venny 2.1.0在线工具绘制韦恩图，得到膈下逐瘀汤作用                     的三维结构图，保存为“PDB”格式；然后将主要活性成
          于 MAFLD 铁 死 亡 的 潜 在 靶 点 。 将 上 述 靶 点 导 入            分及中心靶点的“PDB”格式文件导入 AutoDock 软件进
          STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein               行分子对接。由主要活性成分与中心靶点分子对接的
          interaction，PPI）网络，利用Cytoscape软件进行可视化展             结合能（图 2）可知，SIRT1、Nrf2 与各主要活性成分的结
          示，并利用该软件的“CytoNCA”插件计算各网络中节点                       合能均较高，结合本课题组前期研究及既往研究结
          degree、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中        果 [8，11] ，本研究选择 SIRT1/Nrf2/GPX4 轴，从铁死亡角度
          心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centra-    分析膈下逐瘀汤干预MAFLD的潜在机制。
          lity，DC），根据上述参数的中位数进行二次筛选，得膈下                      2.2 实验验证
                                             [10]
          逐瘀汤作用于MAFLD铁死亡的中心靶点 。                              2.2.1 药液的配制
                                                                                                  [8]
              结果显示，共筛选得到 MAFLD 相关靶点 1 788 个、                     参照《医林改错》和本课题组前期研究 ，取膈下逐
          铁死亡相关靶点 484 个；由上述靶点与膈下逐瘀汤潜在                        瘀汤各组方药材，按当归-桃仁-甘草-红花-五灵脂-川芎-
          活性成分对应靶点（1 030个）取交集的韦恩图（图略）可                       牡丹皮-赤芍-乌药-香附-枳壳-延胡索质量比6∶6∶6∶6∶4∶
          见，共得到三者交集靶点 50 个；由交集靶点的 PPI 网络                     4∶4∶4∶4∶3∶3∶2混合，加10倍量水浸泡1 h，以武火煮沸
         （图略）及其 degree、BC、CC 等相关参数可知，膈下逐瘀                    后再以文火煎1 h，过滤；向药渣中加入8倍量水，以文火
          汤作用于 MAFLD 铁死亡的中心靶点共 8 个，包括肿瘤                      煎煮 30 min，过滤；合并 2 次滤液，经浓缩、冷冻干燥后，
          蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）、JUN、低氧诱导因子          得膈下逐瘀汤冻干粉（得率约 22.7%）。使用前，称取冻
          1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1A）、信号转导及转       干粉适量，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成质量浓度
          录激活蛋白（signal transducer and activator of transcrip‐  为 200 mg/mL（以生药量计，下同）的母液，再以 PBS 稀
          tion 3，STAT3）、SIRT1、白细胞介素 1β（interleukin-1β，       释至所需质量浓度。


          中国药房  2024年第35卷第24期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 24    · 2979 ·
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