Page 35 - 《中国药房》2024年23期
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公司；血小板生成素（thrombopoietin，TPO；批号 300-18-                      表1 PCR引物序列及产物长度
          100UG）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；甘油醛-3-         基因               引物序列（5′→3′）            产物长度/bp
                                                              CD41-F313        上游：GATGAGACCCGAAATGTAGGC  155
          磷酸脱氢酶（GAPDH）、CD41、CD42b 引物均由生工生                     CD41-R449        下游：GTCTTTCTAGGACGTTCCAGTG
          物科技（上海）有限责任公司合成；实时荧光定量 PCR                          CD42b-F57        上游：CTGTGAGGTCTCCAAAGTGGC  145
                                                              CD42b-R221       下游：GTGAGGCGAGTGTAAGGCATC
         （qRT-PCR）试剂盒（批号11736051）购自瑞士Roche公司。                 GAPDH-F108       上游：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT  138
          1.3 细胞                                              GAPDH-R304       下游：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
              MEG-01细胞（人成巨核细胞白血病细胞）由陆军军                      2.4 非靶向代谢组学及靶向能量代谢组学检测

          医大学复合伤研究所惠赠，液氮保存。                                      根据“2.2”项下方法进行细胞分组与处理。因前期
          2 方法                                               实验已证实，细胞于分化培养基中培养 14 d 后，DMSO
          2.1 细胞增殖和活力检测                                      对巨核细胞增殖及伪足的生成无显著影响，故本研究仅
                                                                                                 5
              将 MEG-01 细胞培养于增殖培养基（90％RPMI-                   取溶剂对照组和 LZD 组细胞（各取 6×10 个）进行代谢
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          1640培养基+10％胎牛血清）中，按照每孔接种1×10 个                     组学研究。用预冷生理盐水洗涤细胞2次，用400 μL冷
          的方式将细胞接种于 12 孔板中。将培养至对数生长期                         甲醇-乙腈（1∶1，v/v）提取细胞中代谢产物。在 4 ℃

          的MEG-01细胞分为空白对照组（无处理）、溶剂对照组                        下，以 14 000×g 离心 20 min，收集上清液并干燥，然后
         （4‰DMSO）和 100、200、400、800 μg/mL LZD 组（质量            再溶解于100 μL乙腈-水（1∶1，v/v）溶液中。样品送往上
          浓度依据前期预实验结果设置），每组设置5个复孔。培                          海中科新生命生物科技有限公司，由其运用液相色谱-
          养 4 d 后于光镜下观察各组细胞增殖状态，并使用细胞                        串联质谱技术完成非靶向代谢组学和靶向能量代谢组
          计数仪计数细胞。按照相应试剂盒说明书操作，采用                            学检测。在非靶向代谢组学检测过程中，首先进行主
          CCK-8法检测各组细胞的增殖活力。                                 成分分析，从总体上确定两组间存在显著差异；而后以

          2.2 血小板前体生成情况观察                                    变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）
              将 MEG-01 细胞接种于分化培养基（添加 50 ng/mL                值≥1、P＜0.05 且差异倍数≥1.2 或者差异倍数≤0.83
          TPO）中培养。将培养至对数生长期的 MEG-01 细胞分                      为标准，进行差异代谢产物筛选；最后，利用京都基因
          为空白对照组（无处理）、溶剂对照组（4‰DMSO）和400                      与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and
          μg/mL LZD 组（质量浓度根据“2.1”项下结果确定），每                   Genomes，KEGG）数据库对差异代谢产物进行通路富集
          组设置5个复孔。培养14 d后收集细胞，于光镜下观察                         分析。根据非靶向代谢组学检测结果，进一步进行靶向
          细胞的血小板前体——伪足生成情况并采集图像。将                            能量代谢检测分析，并计算细胞能量代谢相关产物的相

          分化后的细胞以 4% 多聚甲醛固定，加入 β-tubulin 抗体                  对含量。
          进行免疫荧光染色，使用 DAPI 染色剂复染细胞核。使                        2.5 添加丙酮酸对细胞增殖及血小板前体生成的影响
          用激光共聚焦显微镜采集图像，观察视野中各组巨核细                               为评估外源性丙酮酸对细胞增殖及血小板前体生
          胞生成伪足的情况，每组至少记录5个视野，以至少生成                          成的影响，将 MEG-01 细胞分别接种于分化培养基和增
          1 条伪足为判定标准计算各视野中生成伪足的细胞比                           殖培养基中，并均分为溶剂对照组（4‰DMSO）、丙酮酸

          例。使用仪器自带软件测量伪足长度，每个视野中选取                           组（10  mmol/L 丙 酮 酸）、LZD 组（400  μg/mL  LZD）、
          5个伪足进行测量。以空白对照组中1个伪足的长度测                           LZD+丙酮酸组（10 mmol/L 丙酮酸+400 μg/mL LZD）并
          量值为标准，计算其余伪足的相对长度并以此进行统计                           作相应处理，每组设置5个复孔。细胞于增殖培养基中
          分析。                                                培养 4 d 后进行细胞计数；于分化培养基中培养 14 d 后
          2.3 CD41、CD42b mRNA表达检测                            进行细胞内丙酮酸相对含量测定（方法同“2.4”项下），并
              根据“2.2”项下方法进行细胞分组与处理。收集分                       观察血小板前体生成情况（方法同“2.2”项下）。
          化培养基中培养14 d的细胞，使用Trizol试剂裂解，提取                     2.6 统计学方法

          总RNA。以GAPDH为内参，根据qRT-PCR试剂盒使用                          使用SPSS 27.0软件对实验数据进行统计分析。计
          说明书方法检测血小板标记物 CD41、CD42b mRNA 表                    量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          达水平。引物序列及产物长度见表1。                                  组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2024年第35卷第23期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 23    · 2865 ·
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