Page 134 - 《中国药房》2024年23期

[2]
RNA，siRNA）药物、微小 RNA 药物和适配体药物 。自 类、洗脱溶剂的种类及浓度，最终采用液-液萃取（liquid-
®
1998 年首款 ASO 药物 Vitravene（formivirsen）获批上市 liquid extraction，LLE）-SPE联合技术对人血浆中的硫代
[3]
以来 ，截至2024年5月国际上已有20个核酸类药物获 磷酸寡核苷酸及其2种代谢产物进行了定量分析。虽然
[4]
得上市批准 。 HPLC-UV法相对简单，但检测灵敏度较低，无法用于低
核酸类药物的生物分析方法主要有 3 大类，包括基 浓度样品的生物分析。
于配体结合分析（ligand binding assay，LBA）的分析方 2 HPLC-FL法
法 、基 于 定 量 聚 合 酶 链 反 应（quantitative polymerase 基 于 肽 核 酸（peptide nucleic acid，PNA）杂 交 的
chain reaction，qPCR）的分析方法和基于液相色谱分离 HPLC-FL法是使用荧光标记的PNA探针与寡核苷酸碱
技术的分析方法。LBA 分析方法通常是指酶联免疫吸 基配对形成杂交双链体，再采用HPLC法进行检测。该
附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法， 方法近几年已逐步用于血浆及组织中寡核苷酸的定量
包括一步杂交法、两步杂交法、三明治杂交法、双链杂交 分析，其融合了ELISA和HPLC 2种方法的优点，定量下
法和竞争杂交法。该类分析方法几乎不需要样品处理， 限（lower limit of quantification，LLOQ）可达 1 ng/mL，
[12]
灵敏度高，但会受到代谢产物的干扰，尽管后续开发的 甚至更低 。目前已上市的寡核苷酸类药物 patisiran
杂交方法能适当提高选择性，但这种选择性仍不可预 就是采用该法测定的其在临床前及临床样品中的含量，
测 。qPCR 分析方法主要包括茎环法、引物延伸 qPCR 并完成了其药代动力学研究 。该法通过阴离子交换
[13]
[5]
法、Poly A聚合酶加尾法、qPCR探针法等。该类分析方 色谱进行分离，还能有效区分代谢产物，包括3′端、5′端
[14]
[15]
法检测灵敏度最高，可达fg/mL水平，但无法区分寡核苷 代谢产物 及 5′端磷酸化代谢产物 。Ji 等 研究发
[16]
酸本身及其主要较短代谢产物 ，加上引物和探针的设 现，PNA 探针的长度对 PNA/脱氧寡核苷酸（oligodeoxy‐
[6]
计存在一定难度，故应用受限。 nucleotide，ODN）杂交复合物的峰形和色谱分离度至关
基于液相色谱分离技术的分析方法因具有高选择 重要，在 PNA/ODN 杂交复合物稳定的情况下，较短的
性，故能够通过调整色谱条件实现寡核苷酸本身及其代 PNA 探针表现得更好。该研究还采用 ATTO 染料标记
谢产物的分离和定量分析。该类分析方法虽灵敏度 的 12-mer PNA 探针对人血浆中 DNL1818（18-mer，一种
略有逊色，但解决了前两类分析方法中代谢产物干扰的 磷酸二酯ODN药物）的HPLC-FL测定方法进行了验证，
[7]
问题 ，成为了核酸类药物生物分析的重点开发方法。 所得 LLOQ 可达 0.1 ng/mL。HPLC-FL 法灵敏度高、特
该类方法主要包括：高效液相色谱-紫外检测（high per‐ 异性好、血浆样品用量少、无需特殊提取，唯一的挑战是
formance liquid chromatography-ultraviolet detection， 需要设计合适的探针，导致需要更长的方法开发时间，
HPLC-UV）法、高效液相色谱-荧光（high performance 因此通常用于临床研究或临床前研究的后期试验。
liquid chromatography-fluorescence，HPLC-FL）法、液相 3 LC-MS/MS法
色 谱 - 串 联 质 谱（liquid chromatography-tandem mass LC-MS/MS 法结合了液相色谱的分离能力和质谱
spectrometry，LC-MS/MS）法、液相色谱-高分辨质谱 的分析能力，可以高灵敏和高选择性地进行核酸分析，
（liquid chromatography-high resolution-mass spectrom‐ 实现核酸及其代谢产物的定性和定量，有望成为核酸类
etry，LC-HRMS）法、微流液相色谱-串联质谱（microflow 药物生物分析的首选方法 。其中，三重四极杆LC-MS/
[17]
liquid chromatography-tandem mass spectrometry，micro‐ MS法的应用最为广泛，多采用反相离子对色谱法。Ewles
[18]
flow LC-MS/MS）法、杂交液相色谱-串联质谱（hybridiza‐ 等 采用 AB Sciex API 5000 三重四极杆 LC-MS/MS 系
tion liquid chromatography-tandem mass spectrometry，hy‐ 统对人血浆中的trabedersen（一种反义ODN药物）及其6
bridization LC-MS/MS）法。本文综述了基于液相色谱 种 3′端和 5′端代谢产物（5′n-1、3′n-1、5′n-2、3′n-2、
分离技术的分析方法的特点和在核酸类药物生物分析 5′n-3、3′n-3）进行了定量分析，以水-六氟异丙醇-三乙
中的应用情况，以期为核酸类药物临床前和临床研究中 醇胺（100∶1∶0.1，V/V/V）和甲醇-六氟异丙醇-三乙醇胺
生物样品分析方法的开发提供参考。 （100∶1∶0.1，V/V/V）为流动相进行梯度洗脱，可得每种待
1 HPLC-UV法 测成分的线性范围均为 2～1 000 ng/mL。Ledvina 等 [19]
[8]
HPLC-UV法常用于寡核苷酸的制备和纯度验证 。 采用 AB Sciex 6500+三重四极杆 LC-MS/MS 系统建立
使用该法时，寡核苷酸的分离受固定相孔径、流动相添 了人血浆中 AZD8233[16-mer，一种 N-乙酰半乳糖胺
[10]
[9]
加剂和柱温的影响 。Umemura 等 用 HPLC-UV 法检 （GalNAc）偶联的硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸药物]的测
测defibrotide（单链寡核苷酸颗粒的多分散混合物，一种 定方法，成功地将 AZD8233 与 AZD8233-DG（AZD8233
ASO 药物）在人血浆中的浓度，检测线性范围为 10～ 的去糖基化或部分去糖基化形式）进行了分离，LLOQ可
[20]
300 µg/mL。Nuckowski等 采用HPLC法，在260 nm紫 达 0.2 ng/mL。Hemsley 等 使用在线固相萃取（online
[11]
外吸收波长下对硫代磷酸寡核苷酸的固相萃取（solid- SPE，OLSPE）-LC-MS/MS 系统建立了人血浆中 15-mer
phase extraction，SPE）法进行了优化，包括吸附剂的种 未修饰的单链DNA寡核苷酸药物的测定方法，以水（内含

· 2960 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 23 中国药房 2024年第35卷第23期