Page 135 - 《中国药房》2024年23期
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15 mmol/L 三乙醇胺+400 mmol/L 六氟异丙醇）和甲醇-               NAc 修饰的 21-mer RNA，分子量为 8 590.218 8 Da）和
          水（50∶50，V/V，内含15 mmol/L三乙醇胺+400 mmol/L六            N9（经硫代磷酸酯和 2′-氟修饰的 21-mer RNA，分子量
          氟异丙醇）为流动相进行梯度洗脱，LLOQ可达50 pg/mL。                    为 6 674.996 1 Da）的代谢产物进行了鉴定，结果分别鉴
                                                                                          [26]
              近年来，质谱与亲水作用色谱（hydrophilic interac‐             定出27和29种代谢产物。Sun等 采用四极杆-静电场
          tion  liquid  chromatography，HILIC）联 合 的 HILIC-MS/  轨道阱质谱法对大鼠血浆中的 mipomersen（一种 ASO
          MS法引起了广泛关注，因其流动相多为挥发性盐，相对                          药物）进行了测定，并进行了完整的方法学验证，所得
          于反相离子对色谱，与质谱更为兼容，不易引起质谱系                           LLOQ可达0.5 ng/mL。
                                                                     [27]
          统的污染，故已逐渐用于核酸类药物的生物分析 。在                               Li 等 采用 Q-TOF MS 法对一种肝靶向的 ASO 药
                                                   [21]
          流动相的选择中，与甲酸铵相比，乙酸铵因其更好的质                           物 AZD8233 的 11 种代谢产物进行了研究，并证实了动
          谱灵敏度、更强的色谱保留性而备受青睐。Zhang 等                   [22]  物 体 内 代 谢 产 物 与 人 体 内 代 谢 产 物 的 一 致 性 。
                                                                         [28]
          采用AB Sciex API 5000三重四极杆HILIC-MS/MS系统              Kilanowska 等 采用 Q-TOF MS 法对 4 种不同修饰（分
          建立了兔血浆中 nusinersen（一种硫代磷酸酯修饰的                      别经硫代磷酸酯、2′-甲氧基、2′-甲氧乙基、碱基修饰）的
          ASO 药物）的测定方法，在流动相中添加 20 mmol/L 乙                   ASO药物在人肝微粒体孵育后的代谢产物进行了研究，
          酸铵并将 pH 值调整为 10 时，电离效率最高、峰形最好，                     结果显示，这些ASO药物的主要代谢途径均为核酸外切
          LLOQ可达30 ng/mL。该研究采用此法完成了nusinersen                酶进行的3′末端及5′末端的代谢。该研究还发现，代谢
          单次鞘内注射给药和单次静脉注射给药后的药代动力                            产物的数量随着化学修饰引起的寡核苷酸极性的降低
          学研究。                                               而减少，硫代磷酸酯修饰的 ASO 数量＞碱基修饰的
              LC-MS/MS法因其高分离能力及高选择性，能同时                      ASO数量＞2′-甲氧基修饰的ASO数量＞2′-甲氧乙基修
          完成核酸本身及其代谢产物的分离与定量，但需在标准                           饰的ASO数量。
          物质存在的前提下完成，故其应用受到了一定限制。                                LC-HRMS 法能够同时鉴定及定量未知代谢产物，
          4 LC-HRMS法                                         无须使用标准物质；与LC-MS/MS法相比，LC-HRMS法
              目前，LC-HRMS 法已广泛用于大分子药物的生物                      的高分辨率及高质量准确度更能够区分结构相似的代
              [5]
          分析 ，具有超高的质量分辨率和质量准确度（小于 5                          谢产物。一般来说，随着寡核苷酸长度的增加会导致质
          ppm），并在没有对照品的情况下可以实现代谢产物的定                         谱检测灵敏度的降低，因此 LC-MS/MS 法与 LC-HRMS
          性及定量，逐渐成为核酸及其代谢产物分析的重要技术                           法适合分析分子量较小的核酸类药物。
          之一 。近年来核酸类药物分析应用最为广泛的高分                            5 microflow LC-MS/MS法
              [12]
          辨质谱主要有四极杆-静电场轨道阱质谱                 [23―26] 和四极杆        近年来，microflow LC-MS/MS 法因其超高的灵敏
          串联飞行时间质谱（quadrupole time-of-flight mass spec‐      度而备受关注。据文献报道，微流液相色谱（流速为
          trometry，Q-TOF MS）。                                10～100 μL/min）可提高电喷雾质谱中分析物的电离效
              Ji 等 采用四极杆-静电场轨道阱质谱法对食蟹猴                       率，这是因为在低流速下产生的较小液滴具有较大的表
                 [12]
                                                                                                     [29]
          高浓度血浆、肝脏、肾脏和尿液 4 种基质中的 RBD1016                     面积与体积比，从而提供了更高的电离效率 。Jiang
                                                               [30]
         （一种 GalNAc 偶联的 siRNA 药物，包含反义链和有义                    等 开发了一种用于大鼠血浆中 ASO 药物定量分析的
          链）及 其 代 谢 产 物 进 行 了 定 性 和 定 量 分 析 ，发 现             microflow LC-MS/MS法，灵敏度可达0.1 ng/mL；相对于
          RBD1016的反义链在4种基质中的代谢产物是相同的，                        常规的液相色谱，微流液相色谱的灵敏度提高了 4～6
          RBD1016的有义链在4种基质中的代谢产物存在差异。                        倍，且针对洁净程度越高的样本，该方法的灵敏度也越
                                                                            [31]
              [24]
          Li 等 采用四极杆-静电场轨道阱质谱的 3 种模式对                        高。Guimaraes 等 将微流液相色谱与多通道纳升电喷
          REVERSIR-A（一种单链GalNAc偶联的寡核苷酸药物）                    雾质谱相结合用于核酸类药物的分析，结果发现，多通
          及其代谢产物进行了分析，选择全扫描模式用于代谢产                           道纳升电喷雾使寡核苷酸的检测灵敏度提高了300%。
          物的鉴定（扫描范围为 m/z 500～2 000），选择离子检测                       microflow LC-MS/MS 法的灵敏度高，且由于流速
          模式和平行反应监测模式用于定量分析，分辨率分别为                           慢，其流动相的消耗量也极少，因此对质谱的污染较小；
          70 000和35 000。该研究发现了仅存在于食蟹猴肝脏中                     而且，较少量的溶液进入离子源，还有效降低了基质效
          的 REVERSIR-A 的一种新的代谢产物，是由 3′末端的                    应。但特定的仪器决定了其较高的设备成本，故该技术
          2′-O-甲基腺苷转化成的2′-O-甲基肌苷，这是首次观察                      还未得到广泛应用。
          到的外源性给药寡核苷酸末端腺苷的 A-to-I 编辑，两者                      6 hybridization LC-MS/MS法
                                    [25]
          分子量仅相差0.984 Da。Liu等 也用四极杆-静电场轨                         hybridization LC-MS/MS 法在保持了 LC-MS/MS 法
          道阱质谱法对大鼠肝脏匀浆中2种不同修饰的寡核苷酸                           高选择性的同时，其灵敏度可与 LBA 法媲美，已成为近
          N11-GalNAc（经硫代磷酸酯、2′-氟、2′-甲氧基和3′-Gal‐              年来重点开发的方法。该法采用生物素化的捕获探针


          中国药房  2024年第35卷第23期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 23    · 2961 ·
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