Page 136 - 《中国药房》2024年23期
P. 136

偶联磁珠杂交法从生物样本中提取核酸，然后用 LC-                           外，流动相中螯合剂（如乙酰丙酮）的添加、样品中阻断
                                          [32]
          MS/MS 法进行分析，最早由 Dillen 等 于 2017 年报道。                剂（如牛血清蛋白）和表面活性剂（如吐温 80）的加入都
          与传统的 LC-MS/MS 法相比，该法所需样本量更小，96                      可以减少寡核苷酸的非特异性吸附                [30，34，38] ；流动相或工
          孔板即可批量处理样品，耗时更短，且方法更为稳定。                            作溶液中有机溶剂的浓度也会影响寡核苷酸的非特异
              [33]
          Li 等 开发了用于大鼠血浆和脑组织样品中 ASO 药物                        性吸附   [39―40] 。
          定量分析的 hybridization LC-MS/MS 法，能特异性地区               7.2 样品前处理技术
          分ASO及其n-1代谢产物，实现ASO药物及其代谢产物                             样品的前处理是将目标寡核苷酸及其代谢产物从
          的同时定量；且该法灵敏度高，大鼠血浆中的 LLOQ 可                         基质及大分子蛋白中分离出来的关键步骤，对于提高基
          达 0.5 ng/mL，脑组织中的 LLOQ 可达 2.50 ng/g。Li等       [34]  于液相色谱分离技术的分析方法灵敏度至关重要。目
          首次建立了猴血清、脑脊液、组织中ASO-001（一种具有                        前常见的样品前处理方法主要有蛋白沉淀法、LLE 法、
          20 个碱基对的 ASO 药物）定量分析的 hybridization LC-             SPE法。其中，蛋白沉淀法存在较低的回收率和较高的
          MS/MS 法，并证实了该法不受 ASO-001 5 种 3′端和 5′                基质效应，应用较少        [30，41] 。LLE 法及 SPE 法单独用于寡
          端代谢产物（3′n-1、3′n-10、5′n-10、3′n-15、5′n-15）的干          核苷酸的样品制备虽然能得到足够的回收率                    [42―45] ，但单
          扰；同时，该研究团队还进行了 ASO-001 用于猴的毒代                       独的前处理方法往往不能完全除去蛋白质，直接影响方
                                                    [35]
          动力学研究，所得LLOQ可达0.5 ng/mL。Yuan等 首次                    法的灵敏度，因此业界常常将两者结合，用于样品前处
          将hybridization LC-MS/MS法用于猴血清、脑脊液、组织                理 [11，18] 。 研 究 表 明 ，LLE 联 合 SPE 法 用 于 人 血 浆 中
                                                                                                  [19]
          中 siRNA-01（一种双链寡核苷酸药物）的测定，使用                        AZD8233的测定时，LLOQ 可达0.2 ng/mL 。随着前处
          PNA 探针作为捕获探针，获得了满意的回收率（约                            理方法的进一步改进，OLSPE 法也被开发出来，当其用
          90%），且测定过程不受推测的 30 个 n-1 代谢产物的干                     于人血浆中寡核苷酸的测定时，LLOQ 可达 50 pg/mL，
          扰，LLOQ 为 2 ng/mL，且该法还可用于其他 siRNA 药物                 比传统 SPE 法的灵敏度提高了 5 倍 。近年来，迅速发
                                                                                            [20]
          及双链寡核苷酸药物的生物分析。                                     展的杂交提取法备受关注，因具有高度的特异性，该方
              hybridization LC-MS/MS法具有与传统ELISA法相             法可以为各种生物基质（如血浆、组织匀浆液、脑脊液）
                                                                                                [34]
          当的灵敏度，且样品制备过程简单，不涉及提取等复杂                            中的核酸类药物进行高效的样品提取 ，已成为无可
          操作，但生物素化的捕获探针需要特殊试剂的设计和合                            替代的一种前处理方法。杂交提取法与 microflow
          成，开发周期相对较长。                                         LC-MS/MS 法的结合更是将寡核苷酸的测定方法推上
          7 其他相关策略及技术                                         了一个新的高度，采用生物素化的捕获探针偶联磁珠
              近年来，为进一步提高基于液相色谱分离技术的分                          杂交提取法对大鼠血浆中的 ASO 药物进行提取，再使
          析方法的灵敏度，解决核酸的非特异性吸附问题和优化                            用 microflow LC-MS/MS 法进行测定，灵敏度可达 0.1
                                                                   [30]
          样品前处理技术成为了主要路径。                                     ng/mL 。
          7.1 非特异性吸附解决策略                                      7.3 其他
              解决核酸的非特异性吸附问题，可减少样品的损                               另外，还有一些在小分子化合物中应用得比较成熟
          失，提高分析物的回收率，从而提高分析方法的灵敏度。                           的分离技术也在近年中用于核酸类药物的生物分析。
                   [36]
          Nguyen 等 采用 HPLC-UV 及 LC-MS/MS 法，以 25-mer           例如毛细管微取样（capillary microsampling，CMS）法，
          硫代磷酸酯寡核苷酸及不同聚合度的寡聚胸腺嘧啶脱                             即使用毛细管收集少量血液，并使收集的血液在毛细管
          氧核苷酸（15-mer、20-mer、25-mer、30-mer、35-mer）为研          中进一步处理成血浆或血清，然后与样品用量较少的
          究对象，对非特异性吸附问题进行了系统研究。结果表                            hybridization LC-MS/MS 法结合，从而在取样量较少的
                                                                                                [46]
          明，金属材质的液相色谱硬件（色谱柱和液相色谱系统）                           同时保证较高的方法灵敏度。Yuan 等 首次将 CMS
          引起的非特异性吸附问题可以通过增加进样次数来解                             法与 hybridization LC-MS/MS 法联合用于幼年小鼠血
          决，但这种解决办法只是短暂的，且重复性不好；表面混                           浆样品中一种 ASO 药物（20-mer，分子量为 7 100Da）
          合二氧化硅修饰材质的液相色谱硬件几乎不存在非特                             的分析，并成功完成了该药的药代动力学及毒代动力学
          异性吸附问题，相对于金属材质的液相色谱硬件，可使                            评估。
          25-mer 硫代磷酸酯寡核苷酸的回收率提高 73%。该研                       8 结语
          究同时对流动相pH值（4、7、8.5）对结果的影响进行了评                           随着生物分析技术的不断发展，基于液相色谱分离
          估，发现当流动相 pH 值为 8.5 时，25-mer 硫代磷酸酯寡                  技术的分析方法也逐渐完善，基于 PNA 杂交的 HPLC-
                                      [37]
          核苷酸的回收率最高。Zhang等 报道使用硅烷化玻璃                          FL法、LC-HRMS法、microflow LC-MS/MS法、hybridiza‐
          容器配制溶液，并在溶剂中添加离子对试剂（六氟异丙                            tion LC-MS/MS法和OLSPE-LC-MS/MS法等，在保持了
          醇、三乙醇胺）可以减少寡核苷酸的非特异性吸附。另                            原有基于液相色谱分离技术分析方法（如HPLC-UV法）


          · 2962 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 23                            中国药房  2024年第35卷第23期
   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140