Page 57 - 《中国药房》2024年15期
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用生理盐水将牡荆素、Notch激活剂Jagged1溶解成                   沉淀后重悬混匀，上机通过流式细胞仪测定 Treg、Th17
          质量浓度分别为 4、0.1 mg/mL 的溶液。建模成功后，牡                    细胞比例，并计算出Th17/Treg值。
                                           [8]
          荆素组小鼠灌胃 40 mg/kg 的牡荆素 （灌胃体积 10                     2.5 血清中炎症因子水平检测
          mL/kg），同时腹腔注射 10 mL/kg 生理盐水；Notch 激活                   取出“2.3”项下冻存的血清，于 4 ℃下提前缓慢解

          剂组小鼠灌胃10 mL/kg生理盐水，同时腹腔注射1 mg/kg                   冻，采用 ELISA 法测定其中炎症因子（IL-18、IL-6、IL-
                  [9]
          的Jagged1 （注射体积10 mL/kg）；牡荆素+Notch激活剂               17、IL-10）水平，具体步骤参照各自试剂盒说明书进行。
          组小鼠灌胃 40 mg/kg 的牡荆素，同时腹腔注射 1 mg/kg                 2.6 肺组织中Notch信号通路相关蛋白表达检测
          的 Jagged1；模型组和对照组小鼠灌胃和腹腔注射 10                          取出“2.3”项下各组小鼠肺组织蛋白样品液，于4 ℃
          mL/kg生理盐水。每天给药1次，连续14 d。                           下提前缓慢解冻，100 ℃煮沸变性后，各组均取60 µg进
          2.2 肺功能检测                                          行电泳（电压 110 V，电泳时间 85 min），然后湿转（电流
              末次给药后24 h，采用动物肺功能检测仪测定小鼠                       300 mA，转膜时间 90 min）至聚偏二氟乙烯膜上，用 5%
          静息每分钟通气量（minute ventilation at rest，VE）、呼气         脱脂奶粉封闭膜上蛋白。加入 Notch1、DLL4、Hes1、
          峰流速（peak expiratory flow，PEF），以评测肺功能。              β-actin一抗（稀释比例分别为1∶1 060、1∶1 160、1∶1 190、
          2.3 标本采集及肺组织病理形态观察、纤维化变性检测                         1∶1 050），在4 ℃下孵育12 h；洗膜（3次，5 min/次），然后
              肺功能检测结束后，以戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔                    加入羊抗兔二抗（稀释比例 1∶4 500），在 37.5 ℃下孵育
          注射麻醉小鼠，使用注射器刺入小鼠颈总动脉，采集血                           2 h；洗膜（3 次，5 min/次），经化学发光剂显色后拍照。
          液 2 mL。其中每组选出 6 份血液经离心（4 ℃，3 000                   运用 Image J 软件分析得到各组蛋白条带灰度值，各待
          r/min，15 min）后，将血清置于－80 ℃冰箱中冻存备用；                  测蛋白相对表达水平＝待测蛋白（Notch1、DLL4、Hes1）

          各组剩余的 6 份血液经枸橼酸钠抗凝后进行 Th17/Treg                    条带灰度值/内参蛋白（β-actin）条带灰度值。
          值检测。                                               2.7 统计学方法
              以颈椎脱臼法处死小鼠，开腹，解剖取出双肺，每组                            运用 SPSS 26.0 软件处理数据。经 Shapiro-Wilk 检
          切下约 0.6 g 肺组织，剪碎后转移至含有适量高效 RIPA                    验计量资料均符合正态分布，以 x±s 表示，多组间比较
          裂解液的试管中，经电动匀浆器匀浆后离心（4 ℃，3 000                      采用单因素方差分析，两两之间进一步比较行SNK-q检
          r/min，20 min），将获得的蛋白样品液转移到分组标记好                    验。检验水准α＝0.05。
          的干净 EP 管中，采用 BCA 法测出蛋白浓度后调至各组                      3 结果
          浓度等同，然后置于－80 ℃冰箱中冻存备用；剩余肺组                         3.1 牡荆素对哮喘小鼠肺功能的影响
          织置于生理盐水中漂洗干净，以二甲苯透明后进行脱                                与对照组比较，模型组小鼠 VE、PEF 均显著降低
          水、包埋、切片（4 µm），选出完整的肺组织切片，经脱蜡、                     （P＜0.05）；与模型组比较，牡荆素组小鼠 VE、PEF 均显
          水化后，使用试剂盒分别进行 HE（3 张切片）和 Masson                    著升高（P＜0.05），Notch 激活剂组小鼠 VE、PEF 均显著
          染色（3 张切片），以生理盐水漂洗后，再次脱水、透明后                        降低（P＜0.05）；与牡荆素组比较，牡荆素+Notch激活剂
          小心铺开在载玻片上，封片，镜下观察并拍照（任意选 5                         组小鼠 VE、PEF 均显著降低（P＜0.05）；与 Notch 激活剂
          个视野观察）。Masson染色的图像以Image J软件分析，                    组比较，牡荆素+Notch激活剂组小鼠VE、PEF均显著升
          计算出胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。           高（P＜0.05）。结果见表1。
          CVF＝胶原阳性的蓝色面积/组织总面积×100%。                              表1 各组小鼠肺功能指标比较（x±s，n＝12）
          2.4 外周血Th17/Treg值检测                                 组别                       VE/mL       PEF/（mL/s）
                                                              对照组                    159.83±24.09  4.55±0.71
              向“2.3”项下外周血中加入适量红细胞裂解液，混匀                       模型组                    108.41±16.15 a  2.91±0.42 a
          后置于冰水浴中30 min，离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），            牡荆素组                   151.16±22.53 b  4.17±0.68 b
                                                              Notch激活剂组               81.59±13.76 b  1.93±0.34 b
          以预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）           牡荆素+Notch激活剂组          106.93±15.04 cd  2.85±0.39 cd
          洗涤细胞沉淀 1 次后重悬，测出其细胞密度后调至 1×                           a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与牡荆素
          10 个/mL。取 1 mL 细胞悬液，依次加入 FITC 标记的抗                 组比较，P＜0.05；d：与Notch激活剂组比较，P＜0.05。
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          小鼠CD4抗体（标记Treg细胞）、PE标记的抗小鼠IL-17                    3.2 牡荆素对哮喘小鼠肺组织病理形态的影响
          抗体（标记 Th17 细胞），混匀，避光孵育（4 ℃，20 min），                    对照组小鼠肺组织形态结构完整、无损伤；模型组
          离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），以预冷的 PBS 洗涤细胞            小鼠肺泡间隙变大，肺泡部分萎缩融合，气道黏膜及肺


          中国药房  2024年第35卷第15期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 15    · 1851 ·
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