Page 62 - 《中国药房》2024年15期
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经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary in‐            CAT）、CCK-8 以及细胞核和细胞质蛋白质提取试剂盒
          tervention，PCI）是目前治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病                   （批号分别为 051123230901、120822230525、07312323-
          最有效的手段之一，且效果显著；然而 PCI 术后血管再                         1218、101623240117、010423230824）均购自上海碧云天
          狭窄的发生，严重影响了患者的远期疗效                 [1―2] 。在PCI术     生物技术股份有限公司；Nrf2 小干扰 RNA（siNrf2）和阴
          后血管再狭窄发生的过程中，血管平滑肌细胞（vascular                       性对照 siRNA（NC-siNrf2）均购自上海吉玛制药技术有
          smooth muscle cells，VSMCs）的过度增殖、迁移起着非               限公司。
                      [3]
          常重要的作用 。如果能有效抑制VSMCs的过度增殖、                          1.3 动物
          迁移，那么PCI术后血管再狭窄的发生就有可能得到有                               本研究所用的动物为SPF级雄性SD大鼠，共10只，
          效控制。                                                8周龄，体重180～200 g，购自遵义医科大学实验动物中
              近年来，中草药因其更低的毒性、更少的副作用，受                         心，动物生产许可证号为SCXK（黔）2021-0002。所有大
          到广泛关注。延胡索是祖国传统中医的常用药材，具有                            鼠均饲养于12 h光照/12 h黑暗交替、温度19～23 ℃、相
          行气止痛、活血化瘀的功效。延胡索乙素（tetrahydropal‐                   对湿度 55%～65% 的动物房内，饲养期间自由摄食和
          matine，Thp）是从延胡索块茎中分离出来的一种生物碱                       饮水。
          类化合物。现代药理学研究表明，Thp 具有抗炎、抗氧                          2 方法
                                 [4]
          化、改善心血管功能等作用 。然而，现有的报道尚不明                           2.1 大鼠胸主动脉VSMCs的分离及培养
          确Thp是否对VSMCs的过度增殖、迁移具有抑制作用。                             根据参考文献方法 ，从成年雄性SD大鼠的胸主动
                                                                                  [8]
          本课题组前期研究发现，Thp 可通过抗氧化作用来保护                          脉中分离VSMCs。操作步骤如下：将麻醉的SD大鼠置
                                     [5]
          心肌细胞免受高糖诱导的损伤 ，故笔者推测 Thp 有可                         于仰卧位，打开胸部，取下胸主动脉，并将其转移至含有
          能通过抗氧化作用来抑制VSMCs的过度增殖、迁移。                           DMEM/F12 培养基（4 ℃）的培养皿中。去除胸主动脉
              核因子红系 2 相关因子 2（nuclear factor-erythroid 2-      周围的脂肪组织后，纵向切割动脉并将其放置在另一个
          related factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶 1（heme oxygenase-     含有DMEM/F12培养基的培养皿中，用弯曲眼科镊轻轻
          1，HO-1）信号通路具有调节细胞氧化-抗氧化的生物学                         刮取内膜，清除内皮细胞。然后，将动脉剪成大小约1.0
          活性，参与调节 VSMCs 增殖、迁移等过程，是调控血管                        mm 的组织块，均匀铺在培养皿中，在细胞培养室中培
                                                                 2
          再狭窄发生的重要环节           [6―7] 。但目前 Nrf2/HO-1 信号通       养约 30 min，使小组织块黏附到板上；加入含有 20% 胎
          路在Thp对VSMCs过度增殖、迁移中的作用尚不明确。                         牛血清的DMEM/F12培养基，并置于37 ℃、5%CO2饱和
          因此，本研究通过观察 Thp 对血小板衍生生长因子-BB                        湿度培养箱中培养。用显微镜观察 VSMCs 的生长状
         （platelet-derived  growth  factor-BB，PDGF-BB）诱 导 的   态，7 d 左右可见长梭形 VSMCs 的密度达 60%。待
          VSMCs 过度增殖、迁移的影响，并基于 Nrf2/HO-1 信号                   VSMCs的密度达到80%左右时，用0.25%胰酶消化传代
          通路探究其可能的作用机制，为将Thp用于血管再狭窄                           培养，取第4～5代VSMCs进行后续实验。
          的治疗提供理论依据。                                          2.2 细胞分组
          1 材料                                                    根据实验目的，本研究分为 2 部分实验：（1）第 1 部
          1.1 主要仪器                                            分实验为 Thp 抑制 PDGF-BB 诱导的 VSMCs 氧化应激
              MULTISKAN 型全波长酶标仪、3131 型 CO2细胞培                 损伤作用的效应研究。在该部分实验中，将 VSMCs 分
          养箱、ST16型低速台式离心机均购自美国Thermo Fisher                   为 5 个组，分别为对照组、PDGF-BB 组和 Thp 低、中、高
          Scientific 公司；全自动凝胶成像系统购自美国 Bio-Rad                 浓度组，每组设置 5 个复孔。其中，对照组 VSMCs 不经
          公司；CKX-41 型倒置荧光显微镜购自日本 Olympus 公                    过任何处理，正常培养；PDGF-BB组VSMCs以25 ng/mL
                                                                      [9]
          司；Milli-Q型纯水系统购自美国Merck公司。                          PDGF-BB 处理 48 h；Thp 低、中、高浓度组 VSMCs 分别
          1.2 主要药品与试剂                                         予以5、10、20 mg/mL Thp（浓度参考文献[10]并结合预实
              Thp 对照品（批号 AF8111993，纯度≥98%）购自成                 验结果确定）处理 2 h 后，加入 25 ng/mL PDGF-BB 共同
          都埃法生物科技有限公司；兔源Nrf2、HO-1和β-肌动蛋                       孵育 48 h。（2）第 2 部分实验为 Thp 抑制 PDGF-BB 诱导
          白（β-actin）单克隆抗体均购自美国 R&D Systems 公司；                的 VSMCs 氧化应激损伤的机制研究。将 VSMCs 接种
          胎牛血清、胰蛋白酶和青-链霉素均购自美国HyClone公                        于 6 孔细胞培养板中，待 VSMCs 生长密度在 50%～
          司；PDGF-BB 购自美国 Sigma 公司；EdU 细胞增殖检测                  60% 时，进行转染。采用 Lipofectamine 2000 转染技术
          试剂盒（批号U0831）购自广州锐博生物技术有限公司；                         转染细胞，转染 24 h。确定转染成功后，将 VSMCs 分
          活性氧（reactive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶            为 4 个 组 ，分 别 为 PDGF-BB+NC-siNrf2 组（25  ng/mL
         （superoxide  dismutase，SOD）、过 氧 化 氢 酶（catalase，      PDGF-BB+NC-siNrf2），PDGF-BB+Thp+NC-siNrf2组（25


          · 1856 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 15                            中国药房  2024年第35卷第15期
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