Page 38 - 《中国药房》2024年5期
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80 ℃下回流2 h，提取2次；合并提取液，冷却至室温，以                       白的表达水平。
          4 000 r/min 离心 10 min。移取上清液至 100 mL 容量瓶             2.7 裸鼠肿瘤组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相
          中，以50%乙醇定容后，采用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，                          关蛋白和caspase-3蛋白的表达水平检测
          再洗脱纯化2次，将纯化后的样品浓缩蒸干，即得三叉苦                               采用 Western blot 法进行检测。取“2.3”项下每组 3
          总黄酮粉末，得率为0.011%。                                    只裸鼠的肿瘤组织，解冻后剪取适量，经裂解后抽提总
          2.2 动物造模、分组与给药                                      蛋白。将蛋白变性处理后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙
              将Balb/c-nu裸鼠适应性喂养1周后，在裸鼠右侧腋                     烯酰胺凝胶电泳，再转移至PVDF膜；以5%脱脂奶粉封
          窝皮下注射 0.2 mL LoVo 细胞悬液（细胞密度为 1×10              7    闭，加入TLR4（稀释度1∶500）、MyD88（稀释度1∶1 000）、
          个/mL），当裸鼠皮下移植瘤体积达0.5 mm 时，表明造模                      TRAF6（稀释度 1∶4 000）、IRAK-1（稀释度 1∶1 000）、
                                              3
          成功。将造模成功的裸鼠随机分为模型组、5-FU 组（阳                         NF-κB p65 （稀释度 1∶10 000）、caspase-3（稀释度 1∶
          性对照，10 mg/kg，剂量参考文献[12]设置）和三叉苦总                     1 000）、GAPDH（稀释度 1∶5 000）一抗，4 ℃孵育过夜；
          黄酮高、低剂量组（25、12.5 mg/kg，剂量根据预实验结果                    洗膜后，加入相应二抗（稀释度1∶2 000），室温孵育1 h；
          设置），每组 6 只；另设不造模的正常组（6 只，皮下注射                       以洗液漂洗3次后，按化学发光试剂盒说明书操作，采用
          0.2 mL基础培养基）。所有药物均采用含0.3%CMC-Na                     凝胶成像仪进行显影和拍照，并用 Image J 软件进行分
          的生理盐水进行配制。正常组和模型组裸鼠腹腔注射含                            析。以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比
          0.3% CMC-Na 的生理盐水；三叉苦总黄酮高、低剂量组                      值表示目的蛋白的表达水平。
          裸鼠腹腔注射相应药液，每天 1 次；5-FU 组裸鼠腹腔注                       2.8 统计学方法
          射相应药液，隔天1次；连续给药21 d。给药期间观察裸                             采用 SPSS 26. 0 软件对实验数据进行分析和处理。
          鼠的一般情况。                                             符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用
          2.3 取材和裸鼠移植瘤抑制率、肝/脾脏指数的检测                           单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检
              末次给药后次日，称定裸鼠体重，采用眼球摘除法                          验水准α＝0.05。
          取血，分离血清，保存至－80 ℃冰箱备用；采用颈椎脱臼                         3 结果
          法处死裸鼠，剥离肿瘤组织、肝脏组织、脾脏组织，观察                           3.1 裸鼠一般情况观察结果
          并称重，然后计算肝/脾脏指数[肝/脾脏指数＝裸鼠肝脏/                             正常组裸鼠在实验过程中精神良好，饮食量和饮水
          脾脏质量（g）/裸鼠体重（g）×100%]、抑瘤率[抑瘤率＝                      量正常，未见明显不良反应。造模的裸鼠皮下注入
         （模型组平均瘤重－给药组平均瘤重）/模型组平均瘤                             LoVo 细胞后，在第 3 天出现黄豆大小的肿瘤结节；且与
          重×100%]。将肿瘤组织冻存于－80 ℃冰箱中备用。                         正常组裸鼠比较，造模组裸鼠的饮食量和饮水量减少，
          2.4 裸鼠血清中TNF-α、IL-6水平的检测                            体重减轻，肛门潮湿，大便清晰，有腹泻等情况。
              采用 ELISA 法进行检测。取“2.3”项下各组裸鼠的                    3.2 裸鼠移植瘤抑制率和肝/脾脏指数的检测结果
          血清样品适量，根据试剂盒说明书方法操作，检测裸鼠                                与正常组比较，模型组裸鼠的脾脏指数、肝脏指数
          血清中TNF-α、IL-6水平。                                    均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，5-FU组、三叉苦
          2.5 裸鼠肿瘤组织的病理形态学观察                                  总黄酮高剂量组裸鼠的瘤重和肝脏指数均显著降低
              取“2.3”项下肿瘤组织，以 4% 多聚甲醛溶液固定，                    （P＜0.05 或 P＜0.01），三叉苦总黄酮高、低剂量组裸鼠
          经脱水、包埋、切片等处理后，进行常规HE染色，然后采                          的脾脏指数均显著降低（P＜0.05）。5-FU 组和三叉苦
          用显微镜观察肿瘤组织的病理形态学变化，并拍照。                             总黄酮高、低剂量组裸鼠的抑瘤率分别为 55.14%、
          2.6 裸鼠肿瘤组织中 TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水平                   36.91%和15.89%。结果见图1、表1。
          的检测
                                                                 模型组
              采用免疫组化法进行检测。取“2.3”项下每组 3 只
          裸鼠的肿瘤组织，经二甲苯、乙醇脱水后，进行石蜡包
          埋、切片；将切片浸入0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中修                         5-FU组
          复5 min，滴加内源性过氧化物酶封闭液孵育20 min，再
                                                               三叉苦总黄
          滴加山羊血清室温孵育20 min，然后加入TLR4（稀释度                        酮低剂量组
          1∶100）、NF-κB p65（稀释度 1∶2 000）一抗，4 ℃孵育过
          夜；次日，加入相应二抗（稀释度1∶200），再进行DAB显                        三叉苦总黄
                                                               酮高剂量组
          色，以蒸馏水洗涤后，加入苏木素复染，经脱水、透明、中
          性树胶封片后进行镜检，以棕黄色为阳性染色。采用
          Image J软件分析阳性染色区域的光密度值，以此表示蛋                                图1 各组裸鼠的移植瘤肉眼观察图


          · 544 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 5                               中国药房  2024年第35卷第5期
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