Page 81 - 《中国药房》2024年4期
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和绣球藤提取物低、中、高剂量组（1.25、2.5、5 g/kg，以水                 2.4.2 细胞上清液中的 NO、PGE2、TNF-α、IL-6、MCP-1
          为溶剂），每组12只。其中，绣球藤提取物中剂量相当于                         含量检测
          其半数致死剂量（median lethal dose，LD50 ）的 1/10，阿司             取对数生长期细胞，以 2×10 个/mL、每孔 2 mL 接
                                                                                          5
          匹林剂量相当于临床等效剂量。各药物组小鼠灌胃                             种于6孔板中，待细胞贴壁融合后，弃去上清液；将细胞

          相应药液，空白对照组小鼠灌胃水，灌胃体积均为 20                          分为正常对照组、LPS组（200 ng/mL）和绣球藤提取物不
          mL/kg，连续 7 d，每天 1 次。于末次给药后 1 h，除对照                 同质量浓度组（12.5、25、50 μg/mL，根据“2.4.1”项下结
          组外，其余各组小鼠均将致炎剂二甲苯均匀涂布于其                            果设置），每组设3个复孔。正常对照组细胞加入无血清
          右耳廓（50 μL/只）；致炎 1 h 后，各组小鼠脱颈椎处死，                   DMEM 培养基，LPS 组加入含 200 ng/mL LPS 的无血清
          剪下双耳，用 9 mm 直径打孔器分别在同一部位打孔，                        DMEM 培养基，各药物组加入含相应质量浓度药物和
          称 定 耳 片 质 量 并 按 下 式 计 算 耳 肿 胀 度 ：耳 肿 胀 度           200 ng/mL LPS 的无血清 DMEM 培养基。培养 24 h 后，
         （mg）＝造模致炎耳（右耳）耳片质量－自身对照耳（左                          收集细胞上清液，根据相应试剂盒说明书方法操作，使
          耳）耳片质量。                                            用酶标仪检测各组细胞上清液中的 NO、PGE2、TNF-α、
          2.3 绣球藤提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响检测                            IL-6、MCP-1含量。
              取 SD 大鼠，按体重随机分为对照组、阿司匹林组                       2.4.3 细胞中iNOS、COX-2、p65、p-p65蛋白表达检测
         （药性对照，0.17 g/kg，以 0.5% 羧甲基纤维素纳为溶剂）                      采用 Western blot 法检测。取对数生长期细胞，以
          和绣球藤提取物低、中、高剂量组（0.88、1.75、3.5 g/kg，以               2×10 个/mL、每孔2 mL接种于6孔板中，iNOS和COX-
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          水为溶剂），每组10只。其中，绣球藤提取物中剂量相当                         2 的检测按照“2.4.2”项下方法分组、处理；p65 和 p-p65
          于其 LD50的 1/10，阿司匹林剂量相当于临床等效剂量。                     的检测按照“2.4.2”项下方法分组，正常对照组细胞加入

          各组大鼠经麻醉后，去除背部毛发，消毒后切口，将经                           无血清 DMEM 培养基干预 7 h，LPS 组细胞先用无血清
          灭菌处理的 2 个棉球（每个棉球加入 1 mg/mL 的青霉素                    DMEM 培养基干预 6 h 后再加入 200 ng/mL LPS 继续干
          钠溶液 0.1 mL，于 60 ℃下烤干，烘干后重约 75 mg）分                 预 1 h，各药物组细胞先用含相应质量浓度药物的无血
          别植入其两侧腋窝皮下。随后，各药物组大鼠灌胃相                            清DMEM培养基干预6 h后再加入200 ng/mL LPS继续
          应药液，对照组大鼠灌胃水，灌胃体积均为 10 mL/kg，                      干预 1 h。收集各组细胞，以 RIPA 裂解液于冰上裂解，
          连续 7 d，每天 1 次。末次给药后 1 h，各组大鼠脱颈椎                    于 4 ℃下以 14 000×g 离心 6 min，取上清液，采用 BCA
          处死，取出棉球，于 60 ℃下烘干 6 h 后称重并按下式计                     法测定蛋白含量，并加入适量蛋白上样缓冲液，于95 ℃
          算肉芽净重：肉芽净重（mg）＝末次给药后的棉球质                           金属浴中变性。取变性蛋白适量，经十二烷基硫酸钠-
          量－原棉球质量。                                           聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，
          2.4 绣球藤提取物对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞炎症损                  以 5% 脱脂奶粉封闭 1 h；以 TBST 漂洗液洗膜，加入
          伤的改善作用及机制考察                                        iNOS、COX-2、GAPDH 和 p65、p-p65、β-actin 一抗（稀释
          2.4.1 细胞毒性检测                                       比例均为1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；以TBST漂洗液洗
              取 RAW264.7 细 胞 ，接 种 于 含 10% 胎 牛 血 清 的          膜，加入辣根过氧化物酶标记的 IgG 二抗（稀释比例为
          DMEM培养基中，常规复苏、传代后，于37 ℃、5%CO2条                     1∶3 000），室温下孵育1 h；以TBST漂洗液洗膜，以特超
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          件下贴壁培养。取对数生长期细胞，以2×10 个/mL、每                       敏 ECL 化学发光试剂显影后置于化学发光分析仪下曝
          孔0.1 mL接种于96孔板中，待细胞贴壁融合后，弃去上                       光拍照。使用 Image J 软件，对各目的蛋白的条带灰度
          清液；将细胞分为正常对照组和绣球藤提取物不同质量                           值进行分析：以GAPDH为内参，计算iNOS、COX-2蛋白
          浓度组（12.5、25、50、100、200 μg/mL，根据本课题预实               的相对表达量；以β-actin为内参，计算p65、p-p65的相对

          验结果设置），每组设10个复孔。正常对照组细胞加入                          表达量，并记录两者比值（p-p65/p65）。
          无血清 DMEM 培养基，各药物组细胞加入含相应质量                         2.4.4 细胞内p65蛋白核转移检测
          浓度药物的无血清 DMEM 培养基。培养 24 h 后，每孔                         采用免疫荧光法检测。取对数生长期细胞，以 1×
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          加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL；孵育4 h后，弃去上清                   10 个/mL、每皿 2 mL 接种于共聚焦小皿中。待细胞贴
          液，每孔加入 DMSO 150 μL；振荡 10 min 后，使用酶标                壁融合后，去除上清液，将其分为正常对照组、LPS 组
          仪于 490 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，用以反                    （200 ng/mL）和绣球藤提取物 25、50 μg/mL组，每组设 3
          映绣球藤提取物的细胞毒性。                                      个平行皿。正常对照组细胞加入无血清DMEM培养基


          中国药房  2024年第35卷第4期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4    · 455 ·
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