Page 66 - 《中国药房》2024年2期
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单克隆抗体（批号分别为 ab15323、ab60176、ab3611、                 进行HE、Masson染色，使用显微镜观察其肾脏病理损伤
          ab187027、ab45171）均购自英国 Abcam 公司；辣根过氧                和纤维化改变。按病变严重程度进行肾损伤评分：无病
          化物酶（HRP）标记的兔抗山羊免疫球蛋白G（IgG）二抗                        变记0分，轻微病变记0.5分，轻度病变记1分，中度病变
         （批号SE238）购自北京索莱宝科技有限公司；HRP标记                         记2分，重度病变记3分；同时，使用Image J软件对肾间
          的山羊抗兔IgG二抗（批号7074P2）购自美国CST公司。                                                                  [15]
                                                              质纤维化（蓝色为纤维化区域）比例进行半定量分析 。
          1.3 实验动物及饲料
                                                              2.6 小鼠肾皮质中巨噬细胞标志蛋白及AGEs-RAGE/
              10～12 周龄的 SPF 级雄性 KK/Ay 小鼠（24 只）和
                                                              RhoA/ROCK信号通路相关蛋白表达检测
          10～12 周龄的 SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠（6 只）均购自
                                                                  采用Western blot法检测。取“2.3”项下各组小鼠左
          北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可
                                                              侧肾脏适量，分离皮质层，经裂解后，取裂解液分装于
          证号 SCXK（京）2020-0004。高脂高糖饲料（含脂肪
                                                              1.5 mL EP管中，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min；收
          17.9%、蛋白17.5%、碳水化合物48.5%）购自北京华阜康
          生物科技股份有限公司，普通饲料购自南京青龙山动物                            集上清液，以 BCA 法测定蛋白浓度后，于 95 ℃下作变
          繁殖场。所有动物均饲养于南京中医药大学 SPF 动物                          性处理。取变性蛋白适量，经电泳分离后湿法转膜，用
          中心（温度20～25 ℃，相对湿度55%），自由摄食、饮水。                      5% 牛 血 清 白 蛋 白 封 闭 ；加 入 Arg-1、iNOS、RAGE、
          本研究方案遵循南京中医药大学实验动物伦理委员会                             RhoA、ROCK1、β-actin一抗（稀释比例分别为1∶15 000、
          的相关规定（动物伦理申请号201903A019）。                           1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶5 000、1∶5 000），于 4 ℃下
          2 方法                                                孵育过夜；以 PBST 缓冲液洗膜 15 min×4 次后，加入兔
          2.1 模型建立                                            抗山羊 IgG 二抗、山羊抗兔 IgG 二抗（稀释比例分别为
              检测 KK/Ay 小鼠的血糖，将血糖水平≥10 mmol/L                  1∶10 000、1∶5 000），于室温下孵育 2 h；以 PBST 缓冲液
          者作为DM小鼠；高脂高糖饲料喂养2周后，将24 h尿蛋                         洗膜15 min×4次，以化学发光液避光显影，并置于凝胶
                                                  [13]
          白升高10倍以上的DM小鼠作为DN模型小鼠 。
                                                              成像系统下成像。利用Image J软件分析各蛋白条带的
          2.2 分组与给药
                                                              灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值
              将DN模型小鼠随机分为模型组、阳性对照组[二甲
                                                              作为目的蛋白的表达水平。
          双胍，200 mg/（kg·d）]以及 GBE 低、高剂量组[100、200
                                                              2.7 统计学方法
          mg/（kg·d）]，每组6只；另取以普通饲料喂养的C57BL/6J
                                                                  采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，Graph‐
          小鼠6只，作为对照组。各药物组剂量根据本课题组前
          期研究结果及相关文献           [6，14] 设定，并按 10 mL/kg 灌胃相      pad Prism 9软件作图。符合正态分布的计量资料以x±
          应药液（以水为溶剂），对照组和模型组小鼠灌胃等体积                           s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用
          生理盐水，每天1次，连续8周。                                     LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          2.3 取样及处理                                           3 结果
              分别于灌胃0、4、8周时，称定各组小鼠体重，检测并                       3.1 GBE 对 DN 模型小鼠体重、空腹血糖、摄食量及尿
          记录其空腹血糖和 24 h 摄食量、尿量。末次给药后，于                        量的影响
          各组小鼠眼眶取血，至少静置 0.5 h 后，以 3 000 r/min 离                   灌胃 0、4、8 周时，模型组小鼠的体重均显著高于对
          心15 min，吸取上层血清于0.5 mL EP管中，备用；同时，                   照组（P＜0.01）；灌胃 8 周时，各药物组小鼠的体重均显
          处死各组小鼠，分离其两侧肾脏并称重，计算其双侧肾
                                                              著高于模型组（P＜0.01）。灌胃0、4、8周时，模型组小鼠
          脏质量与体重的比值。
                                                              的空腹血糖和24 h摄食量、尿量均显著高于对照组（P＜
          2.4 小鼠血清生化指标检测
                                                              0.01）；灌胃 4、8 周时，各药物组小鼠上述指标均显著低
              取“2.3”项下各组小鼠的血清样品，参照相关试剂盒
                                                              于模型组（P＜0.01）。结果见图1。
          说明书方法操作，以酶标仪检测其血清中趋化因子
                                                              3.2 GBE 对 DN 模型小鼠血清趋化因子和炎症因子水
         （MCP-1）、炎症因子（IL-12、IL-10）、肾功能相关指标
                                                              平的影响
         （BUN、Scr）、AGEs水平。
          2.5 小鼠肾脏病理损伤和纤维化改变观察                                    与对照组比较，模型组小鼠血清MCP-1、IL-12水平
              采用HE、Masson染色法分别进行观察。取“2.3”项                    显著升高，IL-10 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比
          下各组小鼠左侧肾脏适量，分离皮质层，横切后置于                             较，各药物组小鼠血清 MCP-1、IL-12 水平均显著降低，
          10%甲醛固定液中固定，经脱水、石蜡包埋后切片，分别                          IL-10水平均显著升高（P＜0.01）。结果见表1。


          · 188 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 2                               中国药房  2024年第35卷第2期
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