Page 35 - 《中国药房》2024年2期
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2.4 BALF中炎症因子及氧化应激指标检测                             间隔不均匀，肺泡数量显著减少，有明显的炎症细胞浸
              收 集 各 组 剩 余 10 只 大 鼠 的 BALF，在 4  ℃ 下 以          润；阿奇霉素组大鼠肺组织上述病理症状有所改善，且
          3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说               与布地奈德组改善程度相似。结果见图1。
          明书操作，检测其中 TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、CAT、
          MDA水平。
          2.5 肺组织中 VEGF、HIF-1α 和 HIF-2α mRNA 表达
          检测
              BALF 收集结束后，将剩余的 10 只大鼠处死，采用
          Trizol 法提取总 RNA，经 HD-3001 型核酸蛋白浓度检测                                    100μm                    100μm
                                                                      A. NC组                  B. BPD组
          仪检测后将RNA逆转录为cDNA，并进一步扩增。反应
          体系：SYBR Premix 12.5 µL，上下游引物（10 µmol/L）各

          1 µL，cDNA 0.5 µL，ddH2O 10 µL。反应条件：95 ℃预变
          性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，
          共 35 个循环。以 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶（glyceralde‐
          hyde-3-phosphate  dehydrogenase，GAPDH）为 内 参 ，按                          100μm                   100μm
          2 －ΔΔCt 法检测 VEGF、HIF-1α、HIF-2α mRNA 的相对表达                 C.阿奇霉素组                  D.布地奈德组
                                                                →：炎症细胞浸润。
          量。引物序列见表1。
                                                                  图1 各组大鼠肺组织病理学变化（HE染色）
                      表1 引物序列及产物长度
                                                             3.2 大鼠 BALF 中白细胞计数和肺组织中放射状肺泡
          基因名称                                 序列（5′→3′）  产物长度/bp
          VEGF       上游引物5′-CGGATCAAACCTCACCAA-3′    187     计数及肺泡平均截距变化
                     下游引物5′-TCTCCGCTCTGAACGAGG-3′                与NC组比较，BPD组大鼠BALF中白细胞计数、肺
          HIF-1α     上游引物5′-AGTTCC-GCAAGCCCTGAAAGC-3′  152
                     下游引物5′-GCAGTGG-TAGTGGTGGCATTAGC-3′      泡平均截距均显著上调，放射状肺泡计数显著下调（P＜
          HIF-2α     上游引物5′-TGAAAACGGAGTCCGAAGCC-3′  148     0.05）。与 BPD 组比较，阿奇霉素组和布地奈德组大鼠
                     下游引物5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′
          GAPDH      上游引物5′-CAAGTTC AACGGCACAGTCAAG-3′  247  的白细胞计数、肺泡平均截距均显著下调，放射状肺泡
                     下游引物5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′        计数显著上调（P＜0.05）。阿奇霉素组与布地奈德组比
          2.6 肺组织中VEGF、HIF-1α和HIF-2α蛋白表达检测                   较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。
              取出低温保存的肺组织适量，加入 RIPA 裂解液提                      表2 各组大鼠 BALF 中白细胞计数、放射状肺泡计数
          取总蛋白，经蛋白浓度测定后，变性。取变性蛋白样品                                及肺泡平均截距比较（x±s）
                                                                                －1
          适量，电泳分离后转至聚偏二氟乙烯膜，封闭2 h后加入                          组别    白细胞计数（n＝10）/（×10  L ）  放射状肺泡计数（n＝5）/个  肺泡平均截距（n＝5）/μm
                                                                               7
                                                              NC组       26.27±0.96     11.00±1.00   39.93±1.75
          兔源VEGF、HIF-1α、HIF-2α一抗（稀释比例均为1∶1 000），
                                                              BPD组      146.93±4.67 a   4.80±0.41 a  54.40±2.29 a
          于 4 ℃下过夜；次日通过 TBST 缓冲液漂洗后加入羊抗                       阿奇霉素组     71.53±2.90 b   10.27±0.88 b  39.87±1.13 b
                                                              布地奈德组     68.27±2.91 b   10.53±0.92 b  40.93±1.83 b
          兔二抗（稀释比例为 1∶2 000），于室温下孵育 2 h，加入
                                                              F         3 819.510       182.804      233.332
          ECL 显色，置于 GenoSens 220 型凝胶成像系统成像，通                  P          ＜0.000 1       ＜0.000 1     ＜0.000 1
          过Quantity One软件分析VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白与                a：与NC组比较，P＜0.05；b：与BPD组比较，P＜0.05。
          内参蛋白β-actin的灰度值比值，表示目的蛋白表达量。                       3.3 大鼠BALF中炎症因子水平变化
          2.7 统计学方法                                              与 NC 组比较，BPD 组大鼠 BALF 中 TNF-α、IL-6、
              采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。符合正                     IL-1β水平均显著上调（P＜0.05）。与BPD组比较，阿奇

          态分布及方差齐性的计量资料以x±s表示，多组间比较                          霉素组和布地奈德组大鼠 BALF 中 TNF-α、IL-6、IL-1β
          采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检验。                       水平均显著下调（P＜0.05）。阿奇霉素组与布地奈德组
          检验水准α＝0.05。                                        比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。
          3 结果                                               3.4 大鼠BALF中氧化应激指标变化
          3.1 大鼠肺组织病理学变化                                         与NC组比较，BPD组大鼠BALF中SOD、CAT水平
              NC 组大鼠肺组织及肺泡结构正常，未发现损伤症                        均显著下调，MDA水平显著上调（P＜0.05）。与BPD组
          状；BPD 组大鼠肺组织出现明显损伤，肺泡融合变大且                         比较，阿奇霉素组和布地奈德组大鼠 BALF 中 SOD、


          中国药房  2024年第35卷第2期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 2    · 157 ·
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