Page 40 - 《中国药房》2024年2期

鼠禁食不禁水16 h，即第8天上午，正常对照组小鼠灌胃 表1 引物序列及产物长度
纯水，其余4组小鼠灌胃洛哌丁胺（0.004 g/kg）。30 min 基因名称 引物序列（5′-3′） 产物长度/bp
TNF-α 上游引物：TCCCCAAAGGGATGAGAAG 99
后，润肠颗粒低、高剂量组小鼠分别按5、10 g/kg灌胃含
下游引物：CACTTGGTGGTTTGCTACGA
润肠颗粒的墨汁，莫沙必利组小鼠按 0.003 g/kg 灌胃含 IL-6 上游引物：CTTCCCTACTTCACAAGTCCGG 466
下游引物：GCCACTCCTTCTGT
枸橼酸莫沙必利片的墨汁，正常对照组和模型组小鼠灌
IL-1β 上游引物：ACTGTGAAATGCCACCTTTTG 149
胃纯墨汁。25 min 后立即处死小鼠，取出肠道，并将肠 下游引物：TGTTGATGTGCTGCTGTGAG
iNOS 上游引物：CGGCAAACATGACTTCAGGC 129
系膜分离干净，缓慢拉直肠道，以此时测量的肠道长度
下游引物：CAGCCTAGGTCGATGCACAA
作为“肠道总长度”，以从幽门的位置到墨汁的前沿位置 nNOS 上游引物：GGGCTCAAATGGTATGGCCT 109
作为“墨汁推进长度”，计算肠道推进率：肠道推进率＝ 下游引物：AATCTCCGTGCCCATGTACC
smMLCK 上游引物：AGAAGTCAAGGAGGTAAAGAATGATGT 77
[4]
墨汁推进长度（cm）/肠道总长度（cm）×100% 。 下游引物：CGGGTCGCTTTTCATTGC
2.4 小鼠结肠和回肠组织结构观察 5-HT 4R 上游引物：ATGGTCAACAAGCCCTATGC 413
下游引物：AGGAAGGCACGTCTGAAAGA
小鼠取材后，立即将其结肠和回肠组织冲洗干净，
MUC2 上游引物：AGTCTGCTCGTGAAGTGCC 410
取每只小鼠相同位置的一段结肠和回肠放入包埋盒，置 下游引物：GGCAAACACAGTCCTTGCAG
SCF 上游引物：GAATCTCCGAAGAGGCCAGAA 197
于4%多聚甲醛中24 h，乙醇脱水、包埋、切片，将厚度为
下游引物：GCTGCAACAGGGGGTAACAT
4 μm 的石蜡切片进行 HE 染色，中性树脂封片后，置于 c-kit 上游引物：CTCCCCCAACAGTGTATTCAC 88
下游引物：TAGCCCGAAATCGCAAATCTT
显微镜下观察小鼠结肠和回肠组织结构变化。
GAPDH 上游引物：ATGGTGAAGGTCGGTGTGAA 100
2.5 小鼠结肠黏液分泌量观察 下游引物：GGTCGTTGATGGCAACAATCTC
取厚度为4 μm的小鼠结肠组织石蜡切片进行阿尔 2.8 小鼠结肠组织中MUC2和SCF蛋白表达检测
新蓝染色，然后置于显微镜下观察小鼠结肠黏液分泌量 取小鼠结肠组织适量，加入裂解液匀浆处理，使用

（结肠切片中的蓝色部分为小鼠结肠黏液）。
BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测上清液中蛋白浓度并制
2.6 小鼠结肠组织中c-kit蛋白表达检测
备蛋白样品。取蛋白样品20 μg，电泳、转膜，用5%脱脂
取厚度为4 μm的小鼠结肠组织石蜡切片，烤片、脱
牛奶室温封闭1 h，加入MUC2、SCF、GAPDH、Tubulin抗
蜡、水化和抗原修复后，用 5% 山羊血清室温封闭 30
体（稀释比例分别为1∶2 000、1∶1 000、1∶3 000、1∶3 000），
min；加入 c-kit 抗体（稀释比例为 1∶500），于 4 ℃孵育过
于 4 ℃过夜；用 TBST 缓冲液洗 3 次，加入辣根过氧
夜；用 0.02% 磷酸盐缓冲液洗 3 次后，再加入二抗（稀释
化物酶标记的山羊抗兔 IgG（H+L）抗体（稀释比例为
比例为 1∶500），室温孵育 1 h。用 DAB 显色，封片并于
1∶3 000），室温孵育1 h；用ECL显影，曝光并拍照保存。
显微镜下拍照观察，使用Image-Pro Plus软件计算5个视
使用 Image J 软件进行分析，以 MUC2 蛋白与内参蛋白
野中c-kit阳性染色的面积。
Tubulin、SCF 蛋白与内参蛋白 GAPDH 的灰度值比值分
2.7 小鼠结肠组织中炎症因子和促进肠道运动相关因
别计算MUC2和SCF蛋白的相对表达量。
子mRNA表达检测
2.9 统计学分析
取小鼠结肠组织适量，采用 Trizol 法提取 RNA，检
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。所有数
测样品RNA的浓度，按照EZBioscience试剂盒说明书将
据均用 x±s 表示，若方差齐，采用单因素方差分析和
RNA 逆转录为 cDNA，用实时定量 PCR 仪以 GAPDH 为
SNK-q 检验；若方差不齐，采用秩和检验。检验水准
内参，检测炎症因子[肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis
α＝0.05。
factor-α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、
IL-1β、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide 3 结果

synthase，iNOS）]、促进肠道运动相关因子[神经型一氧 3.1 润肠颗粒对便秘小鼠粪便含水量和肠道推进率的
化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、平滑肌 影响
肌球蛋白轻链激酶（smooth muscle myosin light chain 与正常对照组比较，模型组小鼠粪便质地坚硬干
kinase，smMLCK）、5-羟色胺受体4（5-hydroxytryptamine 枯，粪便含水量和肠道推进率均显著降低（P＜0.01）。
4 receptor，5-HT4R）、MUC2、SCF、c-kit]mRNA表达水平， 与模型组比较，润肠颗粒低、高剂量组和莫沙必利组小
采用 2 －ΔΔCt 法进行相对定量分析。引物由北京擎科生物 鼠粪便质地蓬松，粪便含水量和肠道推进率均显著增加
科技股份有限公司合成，具体序列及产物长度见表1。 （P＜0.01）。结果见表2。

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